基于生物信息学分析肝纤维化的关键基因及相关通路研究

张腊英,何安玲,陈明锴 （武汉大学人民医院消化内科，湖北 武汉 430060）

肝纤维化是肝发生广泛的慢性损伤后引起肝修复愈合失调的过程。在慢性病毒性肝炎、胆源性肝病、乙醇、自身免疫性肝炎和非酒精性肝病等的作用下，肝细胞损伤后激活静止的肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）并转化为具有增殖、迁移和收缩能力的肌成纤维细胞。纤维化细胞外基质（extracellular matrix,ECM）主要由肌成纤维细胞产生，如Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维、弹性蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖等，这些细胞具有促进纤维化转录和分泌的特性，在纤维化和炎症反应过程中起关键作用[1]。肝纤维化进展是增加慢性肝病患病风险的重要因素。然而肝纤维化的发生与进展通常较为隐匿，大部分肝纤维化患者会在15～20年进展为肝硬化[2]。肝硬化是进行性肝纤维化的终末期阶段，其并发症如食管胃底静脉曲张出血、难治性腹水、肝性脑病和肝癌等疾病会加速肝硬化的进展[3]。在去除致病因子后肝纤维化过程可能发生逆转，但逆转过程通常较为缓慢或不明显[4]。许多抗肝纤维化研究的药物在动物模型中有较好的抗纤维化效果，但在临床试验中效果不甚显著[5]。当前临床仍缺乏有效且特异的抗肝纤维化药物，因此探索肝纤维化机制并寻找潜在药物治疗靶点具有重要的临床和社会意义。

本研究通过生物信息学分析肝纤维化样本与健康肝样本的差异表达基因，以期发现肝纤维化中相关信号通路和关键基因，为早期肝纤维化的检测和诊断提供新的证据支持，为抗肝纤维化的药物治疗提供潜在的新靶点。

1 材料与方法

1.1 数据来源

从GEO 数据库（https://www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/）GPL28576平台中获得基因表达谱GSE197112，包含4个肝纤维化组织样本和4个正常肝组织样本。

1.2 筛选差异表达基因

Limma（linearmodels for microarray data, DOI:10.1093/nar/gkv007）是一种基于广义线性模型的常用差异表达筛选方法。通过Limma 筛选差异表达基因，将GSE197112 数据集中的数据分为肝纤维化组和非肝纤维化组。设置P值和差异倍数（fold change，FC）进行差异表达基因的筛选。P＜0.01，∣Log2FC∣＞1.5时为差异具有统计学意义。使用R语言绘制火山图和热图。

1.3 功能富集和通路分析

DAVID 是一个公共生物信息学数据库[6]，其在线分析工具可对大量基因或蛋白快速进行处理并得出综合性生物功能注释信息[7]。本研究将差异表达基因中的上调基因和下调基因分别导入DAVID 数据库，以P＜0.05为标准进行筛选。

1.4 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）网络分析及关键基因筛选

STRING（http://string-db. org/）是一个收集了近百万种蛋白种类及蛋白之间相互作用信息的数据库，可以在线分析蛋白相互作用。将获取的差异表达基因导入STRING 数据库以评估其PPI 关系，运用Cytoscape(V3.9.1)中MCODE 插件提取PPI 网络图中的关键蛋白模块，取前5位基因为关键基因，并构建关键基因间的PPI 网络[8]。同时通过Cytoscape 软件中的插件CytoHubba筛选肝纤维化靶点基因。

2 结果

2.1 筛选差异表达基因

通过R4.2.0软件对GSE197112进行提取及处理，结果显示，在该数据集中存在300 个与肝纤维化相关的下调基因和99 个与肝纤维化相关的上调基因。使用R 软件绘制肝纤维化差异表达基因表达的火山图（图1）和热图（图2）。

图1 差异表达基因火山图

图2 聚类热图

2.2 功能富集分析和通路分析

利用DAVID 在线分析工具对肝纤维化数据集中差异表达基因的生物过程、基因的分子功能和细胞组分进行富集分析，差异表达基因主要涉及的生物过程包括有丝分裂检验点、染色体分离、细胞分裂、适应性免疫应答、有丝分裂纺锤体组织、DNA 复制、细胞凋亡过程、有丝分裂纺锤体微管附着在动粒上、免疫应答、中板集合。细胞组分相关分析显示，差异表达基因主要参与动粒、染色体着丝粒区、细胞外空间、细胞外区域、网管复合体、浓缩染色体外动粒、中心体、Ndc80复合体、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、网格蛋白介导的胞吞作用。差异表达基因主要参与的基因的分子功能包括蛋白质结合、MHC Ⅱ类受体活性、钙离子结合、微管结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶激活剂活性、ATP依赖性微管运动活动、模式识别受体活性（图3）。KEGG分析显示，差异表达基因主要富集于细胞周期、p53 信号通路、人T 细胞白血病病毒1 感染、孕酮介导的卵母细胞成熟、产生IgA 的肠道免疫网络、抗原处理和呈递、癌症转录失调、细胞黏附分子等途径（图4）。

图4 KEGG富集通路分析及相关基因

2.3 PPI网络生成及关键基因筛选

利用STRING 数据库构建肝纤维化中差异表达基因表达产物的PPI 网络（图5）。使用Cytoscape 可视化软件根据Degree 值绘制PPI 网络可视化图（图6）。利用Cytoscape 软件中MCODE 插件，根据边和节点的关系，建立关键蛋白模块PPI 网络（图7a）。此外，使用CytoHubba 插件利用MCC 算法筛选排名前5 的关键基因，分别为：TTK、KIF2C、ASPM、DLGAP5、PBK，其相互作用关系见图7b。

图5 PPI网络分析图

图6 通过 Cytoscape软件可视化PPI网络的结果

图7 PPI网络5个模块及hub基因

3 讨论

肝纤维化是一个重大的全球公共卫生健康问题，肝纤维化进展到肝硬化和/或肝细胞癌是影响患者生活质量及预后的主要因素[9]。本研究运用生物信息学方法分析了肝纤维化患者的差异表达基因，使用GO富集分析和KEGG信号通路分析揭示了差异表达基因主要的生物学功能，发现了差异表达基因在肝纤维化发生发展中可能发挥的作用，有助于探索肝纤维化药物治疗的新靶点。

本研究通过KEGG信号通路分析发现肝纤维化差异表达基因富集在细胞周期信号通路。细胞周期信号通路是发生肝纤维化相关信号通路共同交汇的通路之一。Cyclin E1（CcnE1）是一种E型细胞周期蛋白，其在HSC 中大量表达，使细胞周期活性增加，参与HSC 的活化与增殖，促进细胞外基质合成和肝纤维化[10]。随后有研究证明，抑制肝细胞和HSC 中CcnE1表达和细胞周期活性可显著改善肝纤维化[11]。免疫相关途径可能促进了肝细胞癌的发展，IgA 生成途径的肠道免疫网络信号通路参与了肝癌细胞的恶性生物学行为，有助于细胞的增殖和迁移，抑制该信号通路的激活可能是治疗肝细胞癌的潜在机制[12]。孕酮介导的卵母细胞成熟信号通路与肝细胞癌的发生发展密切相关[13-14]。抗原处理和呈递信号通路通过影响炎症反应促进丙型肝炎病毒致癌过程[15]。HOXA9 具有介导细胞分化、凋亡、增殖、侵袭、转移及代谢等功能[16]。本研究中HOXA9 富集在癌症转录失调信号通路上，可能作为研究肝纤维化的潜在靶点。细胞黏附分子如钙黏蛋白黏附家族、整合素家族、免疫球蛋白超家族以及选择素等形成了细胞-细胞和细胞-基质黏附[17]。在肝纤维化中，整合素是ECM、炎性细胞、成纤维细胞和实质细胞之间连接的主要节点，与组织纤维化的启动、维持密切相关[18]。细胞黏附分子与肝纤维化相互影响，其能够通过产生转化生长因子-β（transforming growth factor beta,TGF-β）或介导白细胞迁移促进纤维化，肝慢性炎症和纤维化过程中细胞黏附分子的表达水平会上调。整合素和纤维化的ECM 促进TGF-β 的释放，TGF-β 继而上调整合素的表达并激活HSC 分化为肌成纤维细胞，合成更多的纤维化ECM，进入组织纤维化的循环。研究发现，整合素抑制剂可在体内下调TGF-β 介导的信号通路，从而减少肝纤维化的发生[19]。大多数研究发现上述通路与肝癌的发生发展有关，而与肝纤维化的研究较少，肝纤维化中上述信号通路及差异表达基因可能成为肝纤维化治疗的潜在靶点。

TTK 蛋白激酶由人单极纺锤体1 基因编码，即单极纺锤体1 激酶，对于有丝分裂检查点信号传导和染色体稳定性至关重要。有丝分裂检查点可控制细胞有丝分裂过程[20]。TTK 以p53 依赖性方式激活AKT 途径促进细胞增殖和迁移，进而促进肝细胞癌的发生，在肝细胞癌中起着重要作用[21]。TTK 高表达的肝细胞癌患者生存率较低，抑制TTK 高表达能有效抑制肝细胞癌的发展[22-23]。ASPM 即异常纺锤体样小头畸形相关基因，其高表达可能与乙型肝炎的恶性进展有关，并且与肝细胞癌的预后不良有关[24]。KIF2C 是一种重要的有丝分裂调节因子，在有丝分裂过程中调节细胞周期[25]。KIF2C 与各种细胞周期相关蛋白相互作用，促进细胞生长。KIF2C过表达上调了细胞增殖和细胞周期的关键调节因子PCNA 和CDC20 的表达，通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）途径促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，最终促进肝细胞癌生长和转移，并与预后不良相关[26-27]。DLGAP5 在肝细胞癌中的发展分子机制研究有限，DLGAP5参与细胞周期调节，与肝细胞癌患者的总生存期显著相关，可能是肝细胞癌的潜在生物标志物[28]。PBK 是MAPK 家族的丝氨酸-苏氨酸激酶，可调节细胞生存、增殖、生长、凋亡和炎症[29]。PBK 在肝细胞癌中的表达与免疫细胞浸润呈正相关，其高表达与较短生存期相关，有助于预测癌症预后[30]。本研究确定的关键基因更多地集中在肝纤维化领域，而较少集中在肝细胞癌领域，这些基因有望成为肝纤维化药物治疗的新靶点。

综上，本研究确定了肝纤维化399 个差异表达基因，成功构建了肝纤维化中差异表达基因的PPI网络，并筛选出可能参与肝纤维化过程的5 个关键基因，为寻找肝纤维化新的治疗靶点提供了思路，但未来需要通过实验研究来验证该结论。