BMP7 过表达慢病毒载体构建及其对小鼠主动脉平滑肌细胞钙化的影响

付仕林,易雪娇,潘文旭,尹 纯,康华利,钱德慧 （陆军军医大学第二附属医院心血管内科，重庆 400037）

近年来，血管外科和介入手术飞速发展，大大优化了狭窄和闭塞性血管疾病的治疗。但合并血管钙化严重影响了上述治疗的效果，同时增加了术后血栓形成风险[1]。传统观念认为血管钙化是被动退化过程，近年来发现血管钙化与骨形成相似，是血管壁微环境内主动可调控的细胞介导过程。多种细胞如血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)、内皮细胞、巨噬细胞等参与了血管钙化的发生发展，也包括细胞间对话调节[2]，其中VSMCs 向成骨细胞样表型转化是这一过程的核心环节[3]。有研究发现，内皮细胞Jagged1 在抑制VSMCs 向其他表型转化方面具有重要作用[4]，而骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein7，BMP7）是促进VSMCs向成骨表型转化的关键因子[5]。同时，在成骨细胞中BMP7可通过下游信号转导蛋白抑制Jagged1 蛋白表达[6]。因此，我们推测内皮细胞Jagged1 可能是BMP7 调控VSMCs 钙化的中间分子。本研究采用基因重组方法，构建BMP7 过表达慢病毒载体，分析BMP7 过表达对小鼠主动脉内皮细胞Jagged1 表达的影响及其对共培养VSMCs 钙化的影响，以期为血管钙化的机制研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

20 只2～3 周龄SPF 级KM 小鼠购自陆军军医大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCK（渝）20170002。胎牛血清、DMEM 培养基购自美国Gibco公司；RNAiso plus，DH5α 感受态，核酸内切酶BamHⅠ、XholⅠ购自日本TaKaRa 公司；质粒小量抽提试剂盒购自美国Omega 公司；Hifair®Ⅱ 1st Strand cDNASynthesis Kit (gDNA digester plus)、Hieff UNICON®Universal Blue QPCR SYBR Green Master Mix 购自上海YEASEN公司。Jagged1抗体（兔来源）购自英国Abcam公司，HRP 标记山羊抗兔IgG 二抗购自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠主动脉内皮细胞原代培养及鉴定 参考Kobayashi 等[7]的方法并改良，将10 只KM 小鼠采用颈椎脱臼法快速处死后消毒，在无菌操作台上分离完整的主动脉，剥离主动脉血管周围的脂肪组织以及血管外膜，PBS 反复冲洗后，将主动脉切成大小为1 mm×1 mm的组织块，并内膜朝下均匀种植在多聚赖氨酸包被后的6孔培养皿上；于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中静置培养3 d 后换液；待组织块周围爬出的细胞达到培养皿底面积80%后，用0.25%的胰酶消化传代。通过检测CD31 的方法，免疫组化染色后荧光显微镜下观察鉴定血管内皮细胞。本实验使用的是第3代细胞。

1.2.2 小鼠主动脉VSMCs 原代培养及鉴定 参考郝思雨等[8]的方法进行VSMCs 原代培养及鉴定。按1.2.1中的方法分离10 只KM 小鼠主动脉后，使用显微弹簧剪沿血管纵轴剪开主动脉，用显微镊子剔除血管外膜层，再翻转至内侧轻轻刮去血管内膜层。用PBS冲洗血管中膜层，眼科剪将组织剪至1 mm×1 mm×1 mm 大小。用胶原蛋白酶Ⅰ消化30 min 后，加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM 培养基吹散细胞，移入培养瓶，于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中静置培养3 d 后换液。待组织块细胞长满培养皿底面积80%后，用0.25%的胰酶消化传代。通过检测α-SMA 的方法，免疫组化染色后荧光显微镜下观察鉴定VSMCs。本实验使用的是传代至第3代的细胞。

1.2.3 BMP7 过表达慢病毒载体构建 根据目的基因信息Mouse-BMP7（NM_007557.3）进行序列合成，5'端加上限制性核酸内切酶位点XholⅠ，3'端加上限制性核酸内切酶位点BamH Ⅰ，并将其连入载体pLVX-zsGreen-C1 中（图1）。将合成质粒转化感受态细胞，从平板上挑取克隆菌落，小量抽提质粒并进行鉴定挑出阳性克隆。分别利用限制性核酸内切酶BamHⅠ、XholⅠ双酶切提取的质粒，将酶切产物进行1%琼脂糖电泳，切下片段与目的DNA 大小一致的质粒载体，命名为Mouse-BMP7-pLVX-zsGreen-C1，送上海生工测序鉴定。

图1 质粒信息

1.2.4 慢病毒包装纯化和滴度测定 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，组成为pLVXIRES-ZsGreen1、psPAX2、pMD2. G。其中穿梭质粒pLVX-IRES-ZsGreen1上携带有CMV启动的目的基因，且能表达绿色荧光蛋白筛选标记基因；psPAX2、pMD2.G 含有病毒包装所必须的元件。3 种质粒载体分别进行高纯度无内毒素大量抽提，共转染人胚肾细胞293T细胞，转染后16～24 h更换为完全培养基，继续培养48 h 后，多次收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液；最后，Amicon Ultra-15 100 kDa 对上清液进行浓缩处理，得到高滴度的慢病毒浓缩液，于-80 ℃冰箱保存备用。通过荧光显微镜或FACS 计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。

1.2.5 BMP7 过表达慢病毒感染 在原代培养的第3 代小鼠主动脉内皮细胞上应用制备完成的BMP7过表达慢病毒感染48～96 h 后，通过荧光显微镜检查荧光蛋白表达的情况，以此估算慢病毒对目标细胞的感染效率。提取感染后细胞的RNA，先用随机引物将RNA 反转录成cDNA，随后用qPCR 法对BMP7 过表达慢病毒的感染效率进行检测。内参和目的基因引物如下：GAPDH-F 为GGCAAGTTCAACGGCA CAG，GAPDH-R 为CGCCAGTAGACTCCACGACAT；BMP7-F 为CAGCCAGAATCGCTCCAAGA，BMP7-R 为TGCAATGATCCAGTCCTGCC。

1.2.6 Western blot 检测Jagged1蛋白 设置3组细胞实验：正常内皮细胞为正常对照组，内皮细胞+BMP7 过表达慢病毒感染为BMP7 过表达组，内皮细胞+慢病毒空载体为空载体对照组，每组重复3次。各组细胞裂解后，转移到1.5 mL 离心管中剧烈振荡30 s后放入离心机，于4 ℃下以12 000 r/min 离心15 min，吸取上清液用BCA 法测定蛋白浓度，取等量预处理的蛋白样品上样进行SDS-PAGE 电泳，恒流200 mA 电转1 h至PVDF 膜，5%脱脂奶粉-PBST 室温封闭1 h后，加入Jagged1 和内参GAPDH 一抗，于4 ℃孵育过夜。用山羊抗兔IgG 二抗37 °C 温育1 h。按照ECL 发光试剂盒的说明进行操作，并使用凝胶成像装置进行曝光和拍照。

1.2.7 内皮细胞和VSMCs 共培养体系建立与诱导钙化 参照Fillinger 等[9]的方法建立间接共培养体系。将1.2.6 中3 组细胞分别接种于Transwell 膜上，同时将VSMCs接种于6孔培养板的底部。加入钙化培养基（10 mmol/L β-磷酸甘油、1×10-7mol/L 胰岛素及50 µg/L维生素C)以诱导主动脉VSMCs 钙化，继续培养14 d，每2～3 d 更换培养液。最后用茜素红染色检测VSMCs的钙化情况。每组3 枚盖玻片置入6 孔培养板制备小鼠主动脉VSMCs 爬片。4 ℃冲洗液洗涤细胞爬片2 次，冰丙酮固定20～30 min 后取出。每个VSMCs 爬片加入10 g/L 的茜素红S 试剂(pH=6.3)，室温下染色5～10 min，用蒸馏水冲洗1～2 次后，显微镜下观察染色效果。用紫外可见分光光度计测定562 nm 波长处的光密度（optical density,OD）值。

1.3 统计学分析

使用SPSS 26.0 软件进行数据的统计学分析，呈正态分布且方差齐性的数据2组间比较采用t检验，否则采用校正t检验或秩和检验，多组间比较使用单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠主动脉内皮细胞及VSMCs培养及鉴定

将分离培养的第3代内皮细胞及VSMCs经免疫组化后在荧光显微镜下观察发现，分离的细胞为内皮细胞及VSMCs，且纯度均在95%以上。

2.2 BMP7过表达慢病毒载体酶切鉴定

分别利用限制性核酸内切酶BamHⅠ、XholⅠ酶切重组质粒，将酶切产物电泳，电泳结果见图2；基因测序证实酶切的重组质粒为实验所需的BMP7 过表达慢病毒载体。

图2 BMP7过表达慢病毒载体酶切鉴定结果

2.3 BMP7过表达慢病毒感染细胞荧光鉴定

荧光显微镜观察结果显示，空载病毒与BMP7 过表达慢病毒均成功转染至小鼠主动脉内皮细胞，其转染效率分别约为70%和30%（图3）。

图3 BMP7过表达慢病毒感染细胞与空载病毒感染细胞观察

2.4 BMP7 过表达慢病毒感染主动脉内皮细胞后BMP7 mRNA变化

qPCR 检测结果显示，与正常对照组比较，BMP7过表达组的BMP7 mRNA 相对表达量显著升高（P＜0.01），空载体对照组BMP7 mRNA 无显著变化（P＞0.05），见图4。

图4 各组mRNA相对表达量

2.5 BMP7 过表达慢病毒感染主动脉内皮细胞后Jagged1蛋白表达变化

Western blot 检测结果显示，与正常对照组比较，BMP7 过表达组的Jagged1 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01），而空载体对照组的Jagged1 蛋白表达水平无明显差异（P＞0.05），见图5。

图5 Western blot检测小鼠主动脉内皮细胞Jagged1蛋白的表达

2.6 BMP7 过表达内皮细胞对共培养VSMCs 钙化的影响

茜素红染色结果显示，与感染BMP7 过表达慢病毒的内皮细胞共培养后，BMP7 过表达组VSMCs 的钙化程度较正常对照组和空载体对照组均明显增加（P＜0.01），见图6。

图6 各组茜素红染色情况

3 讨论

VSMCs 向成骨细胞样表型转化包括VSMCs 收缩表型标志物表达降低和成骨细胞标志物表达增高的演化过程，是血管钙化的核心环节[3]。在高龄动脉血管壁中，BMP-Smads、Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog等骨形成关键信号通路的激活以及钙调蛋白、骨保护素等抑制钙化因子的丢失会促使VSMCs 向成骨样表型转化[10]。在老年人主动脉中层及高龄小鼠主动脉VSMCs 中均发现成骨标志物蛋白高表达，同时VSMCs收缩表型标志物明显降低[11]。因此，血管的钙化与VSMCs的成骨细胞样表型转化密切相关。

既往研究提示，BMP7 在血管钙化中可能发挥关键作用。首先，BMP7 通过调节血管相关多能祖细胞的表型可塑性来调节血管钙化[12]。在钙化性动脉粥样硬化标本中，BMP7表达上调最为显著[13]。我们前期研究也发现，衰老可以通过下调miR542-3p 增加其靶基因BMP7 的表达，从而发挥促进VSMCs 向成骨细胞样表型转化的作用[14]，而上调BMP7 是如何导致VSMCs向成骨细胞样表型转化的机制尚不明确。

本实验成功构建了小鼠BMP7 过表达慢病毒载体并感染至小鼠主动脉内皮细胞。qPCR 检测结果提示：转染BMP7 过表达慢病毒的小鼠主动脉内皮细胞中BMP7 mRNA 的表达水平显著上调。Notch 信号通路在血管的发生发展中发挥了较为重要的调控作用[15]。血管壁组织中的Notch 信号系统包括Notch 受体（Notch1～4）和配体（Jagged1、2 和DLL1、3、4）等，其中Jagged1是主要分布在内皮细胞的Notch配体[16]。既往研究表明，在多种细胞中BMP7 可通过下游信号转导蛋白抑制Jagged1 蛋白的表达[6,17]。本研究也观察到BMP7 过表达慢病毒转染的内皮细胞中Jagged1 蛋白表达水平明显降低。因此，Jagged1可能是内皮细胞中BMP7的下游信号分子。

本研究还发现，感染BMP7 过表达慢病毒的内皮细胞与VSMCs 共培养后，VSMCs 的钙化程度增加了2倍。内皮细胞调控VSMCs功能主要通过细胞间直接接触和旁分泌作用实现。有研究发现，Jagged1-Notch3通路是内皮细胞和VSMCs 间交流的关键信号通路[18]。细胞间调控可激活VSMCs 的Notch3 信号并维持其收缩表型，减少其向成骨细胞样表型转化。提示上调内皮细胞BMP7 表达，可降低其Jagged1 表达，并促进共培养体系中VSMCs的钙化。

综上所述，本研究成功构建了BMP7 过表达慢病毒载体并感染至小鼠主动脉内皮细胞。在细胞实验中，我们发现上调小鼠主动脉内皮细胞BMP7 的表达后，其Jagged1 的表达降低，并促进了共培养体系中VSMCs 的钙化。但目前只是内皮细胞调控VSMCs 钙化分子机制的初步探索，内皮细胞Jagged1究竟是通过何种途径影响VSMCs钙化尚需进一步研究。