紫绀型先天性心脏病患儿瘦素及其受体的表达与低氧诱导因子-1α相关

国 蓉，张 森，袁建辉，李肖珏，周姝含，李守军，陈燕燕*

中国医学科学院 北京协和医学院 阜外医院 1.内分泌科；2.小儿心脏外科一病区，北京 100037

瘦素(leptin,LEP)是由脂肪细胞分泌,由肥胖基因编码表达的蛋白质产物,被认为是与能量平衡调节有关的激素[1]。大量研究表明,瘦素的多种生物学作用是通过结合细胞膜上靶瘦素受体(Ob gene receptor,Ob-R),启动相应信号转导系统实现的[2-4],但瘦素在心肌能量平衡调节中的作用尚不清楚。而低氧诱导因子-1a(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)通过与低氧心肌中存在的特定低氧反应元件(hypoxia response element,HRE)结合来激活靶基因的转录[5],对心脏的正常发育、结构重构和功能具有重要作用。

婴儿体重过轻是先天性心脏病手术的独立危险因素。虽然既往研究对紫绀型先心病婴儿的营养和生长状况进行了调查,但尚未明确其与血清瘦素水平之间的关联。瘦素及其受体在心肌能量平衡调节中的作用也尚不清楚。

临床数据检测到HIF-1α通过与胰腺癌细胞、乳腺癌细胞的HRE结合,直接激活和调控Ob-R的转录[6-8],但这并非是肿瘤细胞所特有的。瘦素及其受体参与了低龄低体质量紫绀型先心病的发生发展过程。因此,本研究目的是探讨紫绀型先心病患儿瘦素及其受体的表达和HIF-1α的关联。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 患儿:本研究纳入了2019年1月至2020年10月在阜外医院先心病外科接受手术治疗的52例6月龄以下的先心病患儿,根据动脉血氧分压(PaO2)分为紫绀组30例[PaO2<90 mmHg(1 mmHg=0.133kPa),女性12例,男性18例];非紫绀组22例(PaO2≥90 mmHg,女性9例,男性13例)。参与研究者均签署知情同意书,该研究得到阜外医院机构伦理委员会的批准和支持。具体分组情况:所有患儿均经临床评估和实验室检查(包括胸部X线、心电图、超声心动图和心导管测压)确诊。无一例患儿伴有发育异常或重度肺动脉高压(表1)。

表1 紫绀和非紫绀型先心病患儿的年龄、BMI、瘦素水平Table 1 Age, BMI and leptin levels in children with cyanotic and acyanotic groups

1.1.2 动物:SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠,4周龄,体质量80～120 g,[北京华阜康生物科技股份有限公司提供,动物合格证号 SCXK(京)2020-0004]。

1.1.3 试剂(盒):人瘦素(LEP)ELISA试剂盒和ECL超敏发光液 (赛默飞世尔科技(中国)有限公司);地高辛和 Trizol(默克化工技术 (上海) 有限公司);水合氯醛 (北京雷根生物技术有限公司);甲醛缓冲液(上海联迈生物工程有限公司);苏木精-伊红染色(北京艾普希隆生物科技有限公司);BCA蛋白质含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 患儿入组情况:计算患儿入院时BMI值(体质量/身高2),晨起6点至8点采集血液,动脉血气分析测定PaO2。手术中,在主动脉阻断后立即从右心室流出道获取心肌组织。本研究经阜外医院伦理委员会批准通过,所有患者均签署知情同意书。

1.2.2 动物的分组及处理:将大鼠分为常氧组、低氧组[置于10% O2(低氧) 舱内维持4周];和地高辛干预组[于低氧第14天至第21天腹腔注射地高辛(2 mg/kg)]。

1.2.3 收集标本,测定右室肥厚指数:模型建立后从股动脉取血样本(0.5 mL),在血气分析仪中进行分析。然后打开胸腔后立即取出心脏,并将其解剖成右心室(right ventricle,RV)、左心室+室间隔(left ventricle+ventricular septum,LV+S),通过测定重量以获得右室肥厚指数(RV/LV+S)。

1.2.4 HE检测组织学:分离心脏,用3.7%甲醛缓冲液固定,石蜡包埋,连续切片用苏木精-伊红(HE)染色。在HE染色切片上,示踪100～200个心肌细胞核清晰的心肌细胞轮廓。常规光镜检查和奥林巴斯图像分析仪系统用于组织学分析。

1.2.5 RT-qPCR检测基因表达:取心脏组织80～100 mg,转移到消毒好研磨钵中,加液氮研磨成粉末,参照 Trizol 法提取细胞总RNA,紫外分光光度法测定RNA的浓度,扩增Ob-R的引物序列,上游为: 5′-CA-GATTCGATATGGCTT AAATGG-3′, 下游为: 5′-GTTAAAAT-TCACAAGGG AGGCA-3′,扩增产物的长为 474 bp。扩增内参照 β-actin 基因的引物序列,上游为 5′-CGTAAAGACCTC-TATGCC AA-3′,下游为 5′-AGCCATGCCAAATGTGTCAT-3′,扩增产物的长度为473 bp。PCR的反应条件为: 94 ℃ 45 s,57 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,共进行35个循环。取PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳,紫外照相并行图像分析。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达:取80～100 mg心脏组织,按照说明书方法提取总蛋白,BCA法检测蛋白质浓度。加入5×上样缓冲液,煮沸后经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电(SDS-PAGE,8%)分离蛋白,转膜,5%脱脂牛奶封闭,孵育一抗β-actin(1∶5 000)、LEPR(1∶2 000)、HIF1-α(1∶1 000),4 ℃过夜,TBST洗膜3次,二抗常温孵育1.5 h(1∶10 000),TBST洗膜3次,电化学发光法(ECL)显色曝光,经Image J软件处理并分析图像。

1.2.7 ELISA检测血清瘦素和VEGF水平:4 ℃、3 000×g,离心20 min,取血清保存在-80 ℃。用ELISA试剂盒测定。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 血清瘦素水平与BMI正相关

与非紫绀型相比,紫绀型先心病患儿的BMI水平明显降低(P<0.001)(表1)。

紫绀组VEGF平均水平高于非紫绀组(P<0.05)。而血清瘦素水平无差异。经BMI校正(瘦素/BMI)的血清瘦素水平在紫绀组高于非紫绀组(P<0.05)。先心病患儿的血清瘦素水平与BMI呈显著正相关(r=0.335,P=0.018 6)(图1)。

图1 先心病患儿瘦素水平与BMI呈正相关Fig 1 Correlation between leptin levels and BMI in children with CHD

After 4 weeks of hypoxia (Hyp), HIF-1α and Ob-R were quantitatively detected by Western blot; Ob-R.Ob gene receptor receptor; *P<0.05 compared with the ayanotic group.

2.2 紫绀心肌HIF-1α过表达与低氧促进的Ob-R表达

紫绀组HIF-1α蛋白表达增加。作为阳性对照,HIF-1α过表达后VEGF mRNA表达也明显增强。随着HIF-1α蛋白的过表达,Ob-R蛋白及mRNA表达水平也相应增加(图 2)。

2.3 HIF-1α抑制剂可降低心肌组织Ob-R的表达

低氧组心肌组织Ob-R mRNA表达较常氧组显著升高, 地高辛组Ob-R mRNA表达水平较低氧组下降。地高辛明显抑制低氧组HIF-1α的表达。随着HIF-1α的表达下调后,Ob-R的蛋白水平也明显低于对照组 (图3)。抑制Ob-R的表达的同时既增加了紫绀大鼠体质量 (P<0.05)(图4),又改善了右室心肌重塑程度 (图5)。

Hypoxic rats were given digoxin (2 mg/kg), and saline was used as a control; after 4 weeks of hypoxia, Ob-R was quantified by Western blot (7 rats in each group);*P<0.05 compared with the normoxia group; Hyp.hypoxia;Ob-R.Ob gene receptor receptor;# P<0.05 compared with the hypoxic group.

Hypoxic rats had significant body mass loss compared to normoxic rats, but weight loss was improved after hypoxic rats received digoxin.No significant differences were observed between hypoxic and hypoxic controls; Hyp.hypoxia; *P<0.05 compared with the normoxia group; # P<0.05 compared with the hypoxic group.

A.Hyp rats in normoxia group; B.hypoxia group; C.Hyp rats in hypoxia control group had obvious right heart enlargement, disordered arrangement of myocardial cells and myocardial fibers, broken, missing, and blank areas; D.while Hyp-digoxin group the arrangement of myocardial cells was more regular, and the morphology of RV was also improved than before; RV/LV+S.weight ratio of right ventricle to left ventricle plus septum ;*P<0.05 compared with the normoxia group; # P<0.05 compared with the hypoxic group.

3 讨论

瘦素参与了多种疾病的发病机制[5,9-10],先天性心脏病患儿生长迟缓的原因是多因素的。在紫绀型先天性心脏病中,许多患儿表现出明显的脂肪减少。在本研究中,紫绀组的体质量、BMI明显低于非紫绀组,紫绀组和非紫绀组的瘦素浓度相似可能是意想不到的,但经BMI校正过的瘦素水平呈现显著差异。先心病患儿循环系统中血清瘦素与BMI呈显著正相关。

由于Ob-R的变化对瘦素刺激的敏感性至关重要[11],Ob/Ob-R轴参与了紫绀型先心病患儿的能量代谢。阐明Ob-R调节机制有助于了解先心病患儿心肌组织能量代谢的情况。在本研究中,Ob-R在心肌组织中的表达与HIF-1α的表达高度相关;低氧导致Ob-R mRNA和蛋白的表达增加。

既往研究通过对Ob-R启动子区域的筛选,发现位于HIF832/-828区域的3个潜在的HRE是结合HIF-1α和增强Ob-R表达的关键元件[12-14]。临床资料还检测到瘦素、Ob-R和HIF-1α在乳腺和结肠疾病中的相关性,进一步支持瘦素和Ob-R都是HIF-1α的靶基因,但本研究创新性的证实了在心肌中表达的相关性。紫绀组Ob-R表达显著增加,证实了Ob/Ob-R轴参与了心肌的能量代谢,其内在机制作用还需进一步研究证实。

地高辛是临床常用的正性肌力药物,也是HIF-1α的特异性抑制剂[15]。对于Ob-R高表达的患者,特异性的HIF-1α抑制剂可能有利于改善低龄紫绀型先心病患儿的能量代谢,如果HIF-1α调节Ob-R的表达,HIF-1α的下调可能会削弱这种作用。地高辛动物实验表明,阻断HIF-1α的表达可以下调Ob-R的表达,不仅可以改善紫绀大鼠体质量,还可以改善右室重构。

综上所述, Ob-R在心肌组织中显著表达,HIF-1α可直接调节Ob-R的表达,Ob/Ob-R系统可能是进一步改善低龄紫绀型先心病患儿预后的新途径。