铁死亡在非酒精性脂肪性肝病发病中作用的研究进展

肖艳新，刘 岩，许岭翎，周亚茹*

1.保定市第一中心医院 内分泌科，河北 保定 071000；2.河北医科大学附属第三医院 内分泌科，河北 石家庄 050051；3.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 内分泌科 国家卫生健康委员会内分泌重点实验室，北京 100730

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤,中国NAFLD患病率高达29.8%。铁死亡是一种铁依赖性氧化损伤引起的新型细胞死亡方式,铁代谢异常、脂质过氧化和多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFAs)的聚积都会诱发铁死亡。最新研究发现,铁死亡在NAFLD的发病及进展中起关键作用,通过螯合铁、 减少脂质氧化以及清除自由基可以抑制铁死亡,减轻肝脏损伤[1]。铁死亡抑制剂可能成为治疗NAFLD的新策略。本文就铁死亡在NAFLD发病中的作用进行相关综述。

1 铁死亡及其调控机制

外周循环Fe3+与转铁蛋白结合后通过细胞膜上的受体进入细胞,Fe3+被还原为Fe2+,储存于铁蛋白中。铁过载时,过量游离Fe2+可通过芬顿反应产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS),从而触发对蛋白和脂质的氧化损伤。PUFAs多存在于细胞膜中,在脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)的作用下,被氧化为脂质过氧化氢,从而导致细胞膜的破坏和细胞死亡[2]。胱氨酸/谷氨酸逆转运蛋白(system Xc-)是抗氧化系统的关键蛋白,调节谷氨酸与半胱氨酸的转运,参与谷胱甘肽(glutathione,GSH)及谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的合成,抑制铁死亡。铁稳态失衡、脂质过氧化及系统性Xc-/GSH/GPX4轴失衡为铁死亡发生的标志。

铁死亡机制复杂,存在多种调控机制,GTP环氢化酶1/四氢生物蝶呤/二氢叶酸还原酶通路和还原型辅酶Ⅱ/铁死亡抑制蛋白1/辅酶Q10通路可能通过抑制脂质过氧化、增加膜修复途径抑制铁死亡。多种转录因子如TP53、NrF2、锌指蛋白36等可能通过调控GSH合成在铁死亡中发挥作用[3]。核受体共同活化因子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)是降解铁蛋白的选择性载体受体,可增加铁蛋白降解,导致游离Fe2+水平增加,促进铁死亡。

2 铁死亡在NAFLD发病中的作用机制

2.1 铁过载在NAFLD中的作用

肝脏是铁代谢的主要器官,高铁饮食小鼠出现肝脏铁过载及肝脏纤维化。将高铁饲养小鼠的转铁蛋白基因敲除后,小鼠肝脏铁过载和肝损伤更为严重,表现为ALT水平、肝脏纤维化标志物进一步升高,给予铁死亡抑制剂ferrostatin-1治疗后,肝纤维化明显改善[4]。SLC39A14是一种金属转运蛋白,当转铁蛋白不足时,可以作为转运蛋白将铁转运至细胞,导致细胞铁超载。敲除SLC39A14基因后,高铁饲养小鼠肝细胞可以免于铁死亡。非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)患者肠道对铁的吸收显著增加,通过放血维持体内铁轻度缺乏状态可降低血清谷丙转氨酶水平,减轻肝脏铁蓄积,改善肝脏病理[5]。这些研究提示铁过载在NAFLD发病中发挥重要作用。

铁过载小鼠出现血清铁水平升高,同时伴随氧化应激和脂质过氧化增加,进一步诱发胰岛素抵抗,而胰岛素抵抗是NAFLD发病的重要原因之一。2型糖尿病患者体内铁负荷增高可能是其发生NAFLD及肝酶升高的独立危险因素。在小于45岁女性中,血清铁/铁蛋白比值越高,内脏脂肪含量越低,且进展为严重脂肪肝的风险显著降低[6],充足的循环铁水平可使肝脏铁过载减轻,从而减少肝损伤。铁过载可以诱导miRNA-34a表达增加,miRNA-34a过表达将减少SIRT1转录和蛋白表达。给予小鼠尾静脉注射miRNA-34a慢病毒抑制剂后,小鼠肝脏细胞脂肪变明显减轻,同时SIRT1和PPARα的表达增加。体外实验表明,miR-34a通过作用于SIRT1的3′-UTR的两个候选结合位点抑制SIRT1的表达,提示铁过载通过miRNA-34a/SIRT1途径加重肝细胞损伤[7]。 铁过载还可以激活 Kupffer 细胞产生炎性介质,如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6 等,这些炎性介质可以进一步加剧肝脏胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱,从而促进 NAFLD 的发展[8]

铁调素(hepidin)主要在肝脏合成,能够引起膜铁转运蛋白的内吞和泛素化,从而减少细胞内铁离子排出;同时可抑制转铁蛋白受体,减少对铁的吸收,因此,对铁进出细胞具有双重调节作用。敲除铁调素基因,可导致铁在肝脏大量蓄积。炎性介质可诱导肝细胞铁调素转录,维生素D可以通过调控核因子κB-铁调素途径改善斑马鱼肝细胞铁死亡[9]。铁过载导致的miR-761/hepidin/GPX4轴失衡也参与了肝细胞损伤[10]。

2.2 脂质过氧化驱动肝细胞铁死亡发生

脂质过氧化是铁死亡的主要特征之一, PUFAs在长链脂酰CoA合成酶4(long chainacyl CoA synthetase 4,ACSL4)和脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)的催化下发生脂质过氧化是铁死亡的最终结局。在NAFLD小鼠模型中,抑制ACSL4表达可促进线粒体有氧呼吸,从而增强肝细胞介导的脂肪酸氧化能力,并通过上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(peroxisome proliferator-activa-ted receptor-gamma coactivator-1α, PGC-1α)减少脂质积聚[11]。人类的LOX家族包括6个成员,其中LOX5、LOX12、LOX15与铁死亡有关。LOX12可通过与乙酰辅酶A羧化酶1(acetyl CoA carboxylase 1,ACC1)相互作用诱导铁死亡,加重NASH进展,抑制ACC1的表达可明显改善肝脏脂肪聚积和纤维化[12]。磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(phosphatidylethanolamine binding protein 1,PEBP1)可以与LOX15形成复合物,诱发铁死亡[13],而15-LOX/PEBP1复合物产生的代谢产物可被钙非依赖性磷脂酶A2β(iPLA2β)清除[14],iPLA2β可能是抑制铁死亡的调节蛋白。

2.3 系统性Xc-/GSH/GPX4轴失衡加重肝细胞铁死亡

系统性Xc-/GSH/GPX4轴在抗氧化应激、减轻脂质过氧化中起重要作用[15]。系统性Xc-由催化亚基溶质载体家族7成员11(recombinant solute carrier family7 member11,SLC7A11)和伴侣亚基溶质载体家族3成员2(solute carrier family 3 member 2,SLC3A2)组成。NAFLD患者的血清GSH、GPX4水平高于对照组,提示NAFLD患者体内抗氧化应激系统激活以拮抗氧化应激。核因子2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是调节氧化应激的关键转录因子,Nrf2可以上调GPX4、血红素加氧酶1表达,从而消除ROS聚积[16]。用小干扰RNA干扰GPX4的表达,可导致肝细胞ROS异常聚积[17]。小RNA干扰Nrf2表达后,小鼠肝细胞以及棕榈酸/油酸诱导的HepG2细胞出现转铁蛋白-1、铁蛋白重链-1表达上调以及脂质过氧化等铁死亡相关表现[18]。高铁饮食可降低小鼠肝脏GPX4和SLC7A11的转录和蛋白表达水平,升高ACSL4的转录和蛋白表达。铁过载可抑制Nrf2与GPX4以及SLC7A11基因启动子内抗氧化反应元件结合,进而导致其转录沉默,诱导铁死亡发生[19]。NASH小鼠模型中,铁死亡先于凋亡发生,铁死亡抑制剂可保护肝细胞免于铁死亡,并减轻细胞死亡后免疫细胞的浸润和炎性反应。在蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导的NASH小鼠模型中观察到[20],肝脏GPX4代偿性升高,约为对照组1.5倍。继续用铁死亡诱导剂干预后,小鼠肝酶、肝脏脂肪变性、炎性指标进行性恶化,同时肝脏GPX4表达显著下降、LOX12/15表达增加。应用GPX4激活剂、螯合铁可降低小鼠NASH的严重程度。在NAFLD小鼠模型及AML12肝细胞培养中,发现诱导型GPX4(iGPX4),iGPX4亚型与经典型GPX对肝脏细胞氧化应激和铁死亡具有相反作用。敲除小鼠iGPX4基因后给予高脂饮食诱导,小鼠肝脏的氧化应激、铁死亡和细胞损伤减轻,推测iGPX4可能是GPX4负调控因子[21]。

3 通过铁死亡途径干预NAFLD的药物

3.1 Ferrostatin-1

Ferrostatin-1是经典的铁死亡抑制剂,可清除烷氧自由基,减少PUFA的氧化,比酚类抗氧化剂更有效地抑制铁死亡,而且在抑制铁依赖的脂质过氧化的同时不被消耗。Ferrostatin-1还可与Fe2+络合、减少细胞内不稳定铁的水平,通过减轻铁过载,从而抑制铁死亡,改善NAFLD患者的肝损伤[22]。Ferrostatin-1主要通过有效抑制LOX15/磷脂酰乙醇胺结合蛋白-1复合物抑制铁死亡,其对LOX15的抑制作用较弱[23]。

3.2 噻唑烷二酮类药物

噻唑烷二酮(thiazolidinediones,TZD)类药物如罗格列酮、吡格列酮可以选择性激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR-γ),调节脂质代谢,减少内脏脂肪含量。TZD类药物可抑制ACSL4,减少甘油三酯合成[24]。ACSL4是预测细胞铁死亡的敏感标志物,罗格列酮、吡格列酮抑制铁死亡的作用主要通过抑制ACSL4实现,而非完全依赖其对PPAR-γ的作用。在PPAR-γ基因沉默的细胞中,罗格列酮也能发挥抑制铁死亡作用。此外,TZD的细胞保护作用是预防性的,而非治疗性,即只有在铁死亡出现之前进行治疗,才能使磷脂在足够时间内重塑,从而实现有效保护作用。

3.3 维生素E

维生素E是脂溶性抗氧化剂,能阻止PUFA氧化,减少过氧化脂质的形成。GPX4-/-小鼠出现严重肝细胞变性,并在出生不久死亡,而喂食富含维生素E的母鼠所生的GPX4-/-幼崽可存活,但若后续剥夺维生素E摄入,GPX4-/-幼崽在4周后死亡,维生素E可通过对抗脂质过氧化发挥肝脏保护作用[25]。小鼠肝细胞原代冷培养后出现铁死亡特征,而叙利亚仓鼠因能保持血液及肝脏高维生素E水平,从而防止脂质过氧化,对抗冷培养诱导的铁死亡[26]。

4 问题与展望

铁死亡在NAFLD发生发展中起着重要作用,可能是NAFLD向NASH进展的诱因,抑制铁死亡是治疗NAFLD及预防NASH发生的新靶点。但铁死亡在NAFLD发病中作用机制复杂,目前对铁死亡的认知仍然存在许多未知领域,如铁死亡信号通路及调控因素等,需要进一步的机制及临床研究。