福建省毛豆根结线虫种类鉴定及初侵染来源

王婷 柯叶鑫 周瑶 乔燚 肖顺 程曦 刘国坤

摘要

福建省漳州市一基地毛豆（品種：‘毛豆64’）苗期发生严重根结线虫病，发病株率为78%。为明确其病原的种类及其初侵染来源，通过形态学、分子生物学方法进行了种类鉴定。研究结果表明，该线虫雌虫、雄虫、2龄幼虫（J2）的形态学特征与测量值和拟禾本科根结线虫Meloidogyne graminicola相吻合;基于线虫rDNAITS序列和28S rDNA D2D3序列构建的系统发育树进一步确定其为拟禾本科根结线虫;室内接种试验确定了其致病性。这是首次在福建省毛豆上发现拟禾本科根结线虫。在毛豆基地畦地残留的前作水稻稻茬根内和根际土壤中均分离到大量J2s，经特异性引物扩增确定为拟禾本科根结线虫，研究认为前作水稻根系受拟禾本科根结线虫侵染，在灌溉淹水状态下线虫2龄幼虫和卵在根内与土壤中长期存活，成为轮作毛豆根结线虫病的初侵染源。

关键词

拟禾本科根结线虫; 水稻根结线虫; 鉴定; 系统发育分析

中图分类号：

S 435.2

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022716

Identification and primary inoculum sources of rootknot nematode in Glycine max in Fujian province

WANG Ting， KE Yexin， ZHOU Yao， QIAO Yi， XIAO Shun， CHENG Xi， LIU Guokun*

（College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， State Key Laboratory of Ecological Pest 

Control for Fujian and Taiwan Crops， Fuzhou 350002， China）

Abstract

A serious rootknot nematode disease occurring at the seedling stage of Glycine max ‘maodou 64’， with a disease incidence of 78%， has been found in fields in Zhangzhou region， Fujian province. Morphological measurements of females， males and second juveniles （J2s） matched the original description of Meloidogyne graminicola. Species identification was further carried out by phylogenetic analysis based on the sequences of rDNAinternal transcribed spacer （ITS） region and D2D3 region of 28S rDNA. The inoculation test in greenhouses confirmed the nematode’s pathogenicity. This is the first report of M.graminicola parasitizing soybean in Fujian province. A large number of J2s had been isolated from the root of preceding rice stubbles and rhizosphere soil in ridged fields of the ‘maodou 64’， and the species identification was confirmed with M.graminicola specific primers. These results indicated that the root of the preceding rice was infected by M.graminicola， and eggs and J2s of the nematode survived in waterlogged soil and infected root for a long period of time in irrigated rice cultivation， and became the primary inoculum sources for the rootknot nematode disease when soybeans are planted as a rotating crop.

Key words

Meloidogyne graminicola; rice rootknot nematode; identification; phylogenetic analysis

毛豆Glycine max （L.） Merr.，也称菜用大豆或青毛豆，是未成熟且呈青绿色的食用大豆，营养价值高，在中国具有悠久的种植历史［1］。中国是世界上毛豆的主要出口国，福建、广东、江苏、浙江、安徽、山东、湖南等地是其主栽培区［2］。根结线虫Meloidogyne spp.在世界大多数大豆产区有分布，在美国、巴西等国家的大豆产区发生严重，报道的主要病原线虫有南方根结线虫Meloidogyne incognita、爪哇根结线虫M.javanica、花生根结线虫M.arenaria等［34］。20世纪大豆根结线虫在我国黄淮海豆区、福建、江西等多地有报道，主要种类与国外相似［57］，但后来未有发生危害的进一步相关报道。2017年在我国海南毛豆产区首次发现拟禾本科根结线虫M.graminicola侵染毛豆［8］。2021年12月福建省漳州市龙海区某基地毛豆苗发生了严重的根结线虫病，本文对其种类进行鉴定，并对其初侵染源进行研究，旨在明确毛豆根结线虫病的病原并为其防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

毛豆根结线虫样本采集：2021年9月初，福建省漳州市（24°19′N， 117°45′E）毛豆基地，种植品种为‘毛豆64’，前季种植水稻‘汕优016’，收割后播种毛豆，出苗后9 d，可见毛豆生长不良，矮化，根部具有典型根结症状。采用平行线取样法，调查其株发病率。采集的新鲜样本自封袋装好，带回实验室进行根结症状拍照等。

畦地稻茬根与土壤的收集：因水稻田翻耕起垄后种植毛豆，部分稻茬根系仍保留较为完整，采集稻茬根系与粘附土壤样本，带回实验室检查其中的线虫。

1.2 毛豆根结线虫种群纯化、繁殖保存

单卵囊接种繁育：将新鲜的毛豆根结置于解剖镜下，直接剖取单卵囊，接种到预先培植在灭菌沙壤土（沙∶壤=1∶2）的3～4叶期水稻‘汕优016’苗根部，在室温下进行繁殖。

1.3 稻茬根及土壤根结线虫的分离、繁殖保存

将采集的稻茬根上粘附土壤小心剥离，混合土样后，每份样本称取50 g，采用改良贝尔曼漏斗法［9］进行线虫分离，24 h和48 h各收集1次，合并计数。稻茬根经自来水冲洗后认真观察根结生长情况，将无根结的已褐变根进行剖检，观察根内是否有雌虫或卵囊等;每份样品随机挑取5 g根系剪碎，使用改良贝尔曼漏斗法进行分离［9］。从残留稻桩根上获得的2龄幼虫，接种于同1.2方法繁育的水稻幼苗根部，室温下进行繁殖。

1.4 分离线虫对毛豆的致病性测定

将‘毛豆64’种子直接播种于灭菌的沙壤土中，每盆（高14 cm，直径12 cm）1粒，等苗长到8～10 cm时，将水稻上纯化种群获得的新孵化2龄幼虫配制成300条/mL悬浮液，取6 mL用移液枪接种于土壤根茎部外围2 cm处，均分4点接种，置于L∥D=14 h∥10 h（光期28℃/暗期26℃），相对湿度为60%的培养箱内。处理与清水对照各6株，接种后30 d对根系进行检查。

1.5 病原线虫形态学鉴定

新鲜采回的毛豆根结，自来水洗净后于体视显微镜下用挑针挑取雌虫、卵囊和雄虫。将卵囊挑至装有无菌水的培养皿中，28℃恒温箱孵育2 d获得2龄幼虫。供试线虫的杀死、固定及会阴花纹的制作方法参照张绍升等［9］的方法。采用Nikon显微镜（Eclipse NiU 931609，日本）和配套软件NISElements BR，进行虫态观测，采用De Man公式計算形态测量值。各虫态分别取20个样本。

1.6 病原线虫种类的分子生物学鉴定

1.6.1 DNA提取

线虫DNA提取参照Liu等［10］的方法。挑取水稻根部土壤分离或毛豆根结卵囊新鲜孵化的2龄幼虫1条，在无菌水中清洗2次后，转移至装有10 μL WLB的离心管内，短暂离心后，将离心管放入液氮快速冷冻约1 min，再放入65℃水浴锅内使其融化，反复冻融3次，加入1 μL 1.0 mg/mL蛋白酶K。将离心管放入PCR仪中65℃消化60 min，95℃失活10 min，得到根结线虫DNA提取液，置于－20℃保存备用。

1.6.2 目的片段的PCR扩增及序列分析

选用线虫rDNAITS区通用引物TW81 （5′GTTTCCGTAGGTGAACCTGC3′），AB28（5′ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3′）［11］和28S D2D3区通用引物D2A （5′ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG3′），D3B （5′TCGGAAGGAACCAGCTACTA3′）［12］。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。25 μL反应体系：2.5 μL DNA模板，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL， ddH2O 8 μL，Premix TaqTM（TaKaRa，大连宝生物公司）12.5 μL。PCR反应程序：94℃预变性4 min;94℃ 30 s，55℃ （ITS区）或54℃ （28S D2D3区） 30 s，72℃ 40 s，35个循环;72℃ 10 min，4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶检测合格后送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，上传GenBank获得序列号。将所得目的片段序列在NCBI进行BLAST比对，选取序列相似度最高的类群作为建树序列。通过采用MAFFT version 7［13］程序中GINSI模型进行序列的多重比对;在CIPRES Science Gateway （www.pholy.org）［14］运算平台上进行序列分析。运用程序MrBayes on XSEDE，采用GTR+I+G模型构建贝叶斯树［15］;运用程序RAxMLHPC2 on XSEDE［16］，采用GTRCAT模型构建极大似然树［17］。根据序列设定分析运算运行5×106～1×107代，最大似然法的自展重复设定为1 000次。最后采用Figtree v 1.4.3和Adobe Illustrator CC在贝叶斯50%多数原则一致树上标注ML自展值和后验概率。

1.6.3 特异性引物验证田间样品中线虫种类

田间随机采集毛豆根结、残留稻茬根部根结及根土壤样本各8份，剖取根结雌虫、改良贝尔曼法分离根内和土壤中2龄幼虫，提取各样本中单条线虫的DNA，采用拟禾本科根结线虫特异

性引物MgF（5′TTATCGCATCATTTTATTTG3′），

MgR（5′CGCTTTGTTAGAAAATGACCCT3′）［18］进行扩增。PCR反应程序：95℃ 4 min;94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 35 s，35个循环;72℃ 10 min，4℃保存。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2 结果与分析

2.1 毛豆根结线虫病田间症状及发病率

田间毛豆出苗9 d，受根结线虫严重侵染后，植株明显矮化，生长衰退，叶片失绿黄化，受害根部主根与侧根尖处出现大小不一的根结，呈现不规则隆起或锤状肿胀，但典型特点是呈钩状或靴状（图1a， b）。在体视镜下解剖根部根结，可见根内有1至多个根结线虫未成熟雌虫。经调查发现受害地块毛豆发病率为78%。

2.2 线虫的形态学特征

雌虫呈球形、梨形或椭圆形，乳白色，颈部细长，多数雌虫尾部稍隆起（图1c）。会阴花纹整体呈椭圆形，背弓中等偏低，侧区侧线不明显，会阴花纹整体线纹较为连续且平滑，背区线纹会被细碎的短线纹截断，形成不规则的条沟，似人为撕裂般;侧尾腺孔小，明显，间距窄，小于阴门裂长度（图1d～g）。

毛豆根结线虫形态测量值见表1。通过形态鉴定，除2龄幼虫b值［（4.5～6.7） μm vs （2.9～4.0） μm］和雄虫最大体宽［（40.3～50.5） μm vs （24.0～34.7） μm］偏大以外，其余测量值均与拟禾本科根结线虫的描述相符［19］。

1） 表中数据为平均值±标准差。n：标本个数;L：体长;a：体长/体宽;b：体长/唇至食道腺与肠交界处的长度;b′：体长／唇到食道腺末端的长度;DGO：背食道腺开口至口针基球的距离;PHPH：两侧尾腺孔的距离;APH：肛门到两侧尾腺孔中心点的长度;VA：阴门至肛门的长度;H：尾部透明区长度。

Data are mean±SD. n： Number of specimens measured; L： Body length; a： Body length/body width; b： Body length/length from the lip to the junction of esophageal gland and intestine; b′： Body length/length from the lip to esophageal gland end; DGO： The distance from dorsal esophageal gland orifice to the stylet base; PHPH： Length of two phasmids; APH： Length from anus to the midpoint of phasmids; VA： Length from vulva to anus; H： Length of tail hyaline portion.

2.3 毛豆根結线虫种群在水稻上的繁殖

将毛豆上分离的单卵囊接种在水稻‘汕优016’上30 d后，根尖顶端有明显的锤状、钩状或靴状的根结（图1h），根结内有卵囊、雌虫与孵化的幼虫，表明水稻品种‘汕优016’是根结线虫的良好寄主。

2.4 分离线虫对毛豆的致病性

接种后30 d对盆栽毛豆进行检查，接种根结线虫的处理植株明显矮化，只有未接种线虫对照株高的70%左右（图1i），清洗毛豆的根部，对照株无根结，根细长、多，而处理株毛豆的根数量少，根长只有对照株的40%左右（图1j），根结与田间毛豆的根结症状相似，根系发生不同程度的肿胀，并呈钩状或靴状，从根结处可进一步长出细根，可再受侵染，有的根结呈萝卜状（图1k， l）。体视镜下对根结进行解剖，可观察到根内雌虫、雄虫及卵粒，雌虫尾尖稍有隆起，与田间拟禾本科根结线虫雌虫形态一致，研究结果表明分离的根结线虫对毛豆具有致病性。

2.5 田间稻茬根上根结及分离的根部线虫

前作稻茬根际土壤每50 g中分离的根结线虫2龄幼虫数量33.5～125.4 （平均73.3）条;稻茬根用自来水冲洗后发现，12个稻茬中有7个在根部前端有少许根结（图1m），将没有根结的褐根剖检，未见雌虫或卵囊，可见2龄幼虫游离出，剪碎后均分离到根结线虫2龄幼虫，6.40～38.6 （平均22.4） 条/g。将2龄幼虫接种于水稻‘汕优016’根部，30 d后有明显根结产生。

2.6 分离线虫的分子生物学鉴定

毛豆与稻茬的根结卵囊孵化的2龄幼虫，经rDNAITS区与28S D2D3区序列扩增，得到6条序列，并上传GenBank，获得登录号。分别为rDNAITS区：ON024384（毛豆），ON024385（毛豆）;ON024382（水稻），与拟禾本科根结线虫（MT159689、MN647545、KR604730）的序列相似性达98.27%～99.31%;28S D2D3区：ON032632（毛豆），ON032633（毛豆）;ON032630（水稻），均与拟禾本科根结线虫（MT159675、KF751066、MW490724）的序列相似性达99.61%～100%。采用贝叶斯法和极大似然法，基于ITS区和28S D2D3区序列所构建的系统进化树显示，毛豆根结线虫与其他拟禾本科根结线虫种群位于一个进化分支（PP/BS=1/100）中，并与其他根结线虫明显区分（图2a，b），因此将其鉴定为拟禾本科根结线虫。

利用拟禾本科根结线虫特异性引物MgF/MgR，对毛豆根结线虫雌虫、稻茬根部分离雌虫、稻茬根内及土壤中分离的2龄幼虫分别进行PCR检测，所有样本均得到369 bp的目的条带，这一结果与文献报道［18］相符，对照象耳豆根结线虫未有条带，进一步证明了寄生毛豆与水稻上的根结线虫为拟禾本科根结线虫。

3 结论与讨论

本研究从福建省漳州地区发现毛豆根结线虫，通过形态学、分子生物学与致病性测定，明确为拟禾本科根结线虫，这是福建省首次发现该线虫为害毛豆，且造成严重危害;这是我国继海南省发现拟禾本科根结线虫为害毛豆［8］的第二次发现，表明一些毛豆品种是拟禾本科根结线虫的易感寄主品种，可造成严重损失。我国现有的毛豆品种种类众多，包括本地选育品种和从中国台湾、日本等地引进的品种［2］，但毛豆品种对于拟禾本科根结线虫的感抗性尚无人研究。

拟禾本科根结线虫广泛分布于热带与亚热带地区，其寄主广泛，可侵染禾本科、十字花科等的100多种植物，是水稻上的最重要的病原线虫之一，又被称为水稻根结线虫［20］。该线虫在我国最早于海南的葱Allium fistulosum［21］上发现，后相继在福建［22］、湖北［23］、湖南［24］、江苏［25］、浙江［26］、江西［27］、四川［28］等省份水稻种植区发生。本研究中毛豆基地的前季作物为水稻‘汕优016’，8月份收割后即开始翻地整垄播种毛豆，出苗后9 d即发现严重根结，发病株率高达78%，由于水源为干净溪水，因此判断初侵染源应来自田间。但调查中农户反映前季水稻生长正常，产量符合预期，并未出现拟禾本科根结线虫造成水稻黄化、矮化、结实少等严重症状。作者田间调查发现残留稻茬根系只有少许根结，但在田间残留稻茬根系内及田间土壤均分离到较大量的2龄幼虫，经接种试验与分子生物学检测鉴定为拟禾本科根结线虫，表明其初侵染来源于前季水稻根系和土壤。拟禾本科根结线虫为定居型内寄生线虫，卵囊可产在水稻根内，2龄幼虫可迁移至土壤或在根内直接迁移、繁殖［20，29］。拟禾本科根结线虫能够侵染旱稻、灌溉稻、深水稻、低洼地水稻，但其适合在湿度32%、温度22～29℃的土壤中生长，在长期淹水

状态下2龄幼虫无法侵染且生长会受到抑制，在淹水状态下不能侵入根系而以卵或2龄幼虫在根内或土壤中长期存活，2龄线虫数量在4个月后会下降严重，但卵块可存活至少14个月［3031］。从本研究结果来分析，发生地前季水稻为灌溉稻，水稻根部可能在育秧期或苗期浅水阶段受到拟禾本科根结线虫的侵染并繁殖，但因水稻生育期内持续灌溉或间歇灌溉为常态，线虫种群以卵或2龄幼虫在根内或土壤中长期存活，并未对水稻产量或外观造成明显影响，后成为下一季轮作毛豆的初侵染源。毛豆在南方省份广泛种植，为提高土地产出率和经济效益，减少连作障碍与土传病害，毛豆与其他作物轮作成为重要的栽培模式［3235］。如福建省曾有直播稻苗发生严重的拟禾本科根结线虫为害［36］，其侵染源来自前季蔬菜;成都平原水稻与蔬菜轮作田间拟禾本科根结线虫检出率为40.9%［37］。因此随着毛豆稻或菜轮作栽培模式的普遍推广，毛豆拟禾本科根结线虫病问题可能会普遍发生。对于该线虫病的防控，可因地制宜选用抗性品种、农业防治、化学防治等综合措施。选用抗病的毛豆品种最为经济、有效，不同毛豆品种对于该线虫的抗性差异明显，但尚未有系统测定。利用水旱轮作是减少拟禾本科根结线虫病最直接、有效的措施之一，可通過水稻田长期淹水达到减少或消灭线虫种群数量的目的［20］;必要时在整畦时或毛豆苗期施用阿维菌素颗粒、噻唑膦颗粒等杀线虫剂。

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（责任编辑：杨明丽）