玉米根际多功能促生菌的筛选及其对冬小麦-夏玉米轮作体系产量提升效果

常泸尹 王中华 李凤敏 高梓源 张辉红 王祎 李芳 韩燕来 姜瑛

（河南农业大学资源与环境学院，郑州 450046）

黄淮海平原是中国小麦（Triticum aestivum Linn）和玉米（Zea mays Linn）的重要产区，小麦和玉米的播种面积分别占全国播种面积的38%和28%（国家统计局http://www.stats.gov.cn/sj/zxfb/202302/t20230203_1901673.html）。冬小麦-夏玉米轮作体系是黄淮海平原地区主要的农粮生产体系，保证了该区粮食的高产。然而，黄淮海平原这一地区长期以来采用的传统耕作模式会对农田土壤产生频繁的干扰，导致土壤水分保持能力下降、土壤结构疏松，并会进一步导致农田土壤养分的流失［1］。同时不合理施肥导致土壤环境变差，破坏了土壤中微生物与其他生物的平衡，造成作物产量与品质的降低。随着氮磷养分的不断积累，农业面源污染势必会危害国家的粮食安全，影响人民大众福祉。因此，如何合理优化轮作模式下的施肥策略是该地区农业生产可持续发展亟待解决的关键问题。

植物根际促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指那些通过加快物质循环、减弱非生物胁迫、产生植物激素、改善土壤环境等特性，以达到促生效果的微生物［2］，已被广泛用于作物增产和加强植株抗逆性［3-5］。PGPR可以直接通过溶磷、解钾等功能，提高作物对土壤中氮磷钾的利用率，分泌植物激素如吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA），达到促进根的伸长和生长的作用，提高作物汲取水分和养分的能力；间接诱导植物启动自身的防御机制，调节植物内激素的平衡，增加细胞膜的稳定性，增强植物清除活性氧的能力，提高植物对生物与非生物胁迫的抗性［6-7］。目前关于PGPR的应用已取得较好进展，其促生效果和生防能力被广泛应用在不同类型的作物中［8-10］。然而PGPR作为一类多样且复杂的微生物群体，在不同环境不同作物上的应用效果往往存在差异。因此筛选能与多种植物建立共生关系、对不同植物的生长和发育产生积极影响的广谱性促生菌变得尤为重要。

砂质潮土是黄淮海平原上种植小麦、玉米等粮食作物的一种主要农田土壤类型。具有颗粒粗大、结构较差、保水保肥能力较弱等特点，严重限制了小麦、玉米等粮食作物的增产稳产。本研究从玉米根际砂质潮土中筛选出一株具有产IAA能力，同时兼具溶有机磷、解钾能力的多功能促生菌，对其进行鉴定、培养条件优化、盆栽促生试验，并在小麦玉米轮作大田中应用，研究其对土壤养分、作物产量因素等指标的影响，以期提升砂质潮土上小麦玉米的增产潜力，探究根际促生菌在复杂轮作条件下的应用效果，拓展优质菌种资源，为根际促生菌在非寄主作物的应用方向提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土壤 从农业农村部华北小麦玉米轮作营养与施肥科学观测实验站采集几株长势较好的玉米，分离其根际土，用于多功能促生菌的筛选。土壤基本性状如表1。

表1 供试土壤基本性质Table 1 Basic properties of soil for testing

1.1.2 培养基 LB固体培养基：蛋白胨（10.00 g）、酵母提取物（5.00 g）、氯化钠（10.00 g）、琼脂（20.00 g），蒸馏水（1 000 mL）溶解。调整其pH值为7.0-7.2，经121℃高温灭菌，持续时长20 min。

LB液体培养基：不加琼脂，其他条件同上。

蒙金娜培养基：葡萄糖（10.00 g）、硫酸铵（0.50 g）、七水硫酸镁（0.30 g）、氯化钠（0.30 g）、氯化钾（0.30 g）、硫酸亚铁（0.03 g）和硫酸锰（0.03 g），蒸馏水（1 000 mL）溶解。将培养基经过115℃高温灭菌，持续时长为30 min。

有机磷液体培养基：1 000 mL蒙金娜培养基中加入酵母膏（0.40 g）和可溶性卵磷脂（0.20 g），其他条件一致。

解钾液体培养基：蔗糖（10.00 g）、酵母膏（0.50 g）、硫酸铵（1.00 g）、磷酸氢钠（2.00 g）、七水硫酸镁（0.50 g）、碳酸钙（1.00 g）、钾长石粉（1.00 g），蒸馏水（1 000 mL）溶解。将培养基经过121℃高温灭菌，持续时长为20 min。

无机盐液体培养基：硫酸铵（2.00 g）、磷酸二氢钠（0.50 g）、磷酸氢二钾（0.50 g）、七水硫酸镁（0.20 g）、二水氯化钙（0.10 g），蒸馏水（1 000 mL）溶解。将培养基的pH调整为7.0，经121℃高温灭菌，持续时长为20 min。

1.2 方法

1.2.1 多功能促生菌的筛选及功能鉴定

1.2.1.1 菌株的分离纯化 将10.00 g供试土装入含90 mL无菌水和玻璃珠的250 mL锥形瓶中。在30℃条件下，以150 r/min振荡20 min，使其混合均匀。静置10 min，得浓度为0.1 g/mL的菌悬液。稀释上述制得的菌悬液，得浓度分别为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6g/mL的菌悬液。从稀释度为10-4、10-5、10-6g/mL的菌悬液中，各吸取100 μL，涂于LB固体培养基上。放入30℃恒温箱倒置培养1 d。培养结束后，挑选出具有不同形态和特征的典型单个菌落，进行纯化处理。编号，将其保存在4℃的条件下。

1.2.1.2 菌株产IAA能力的测定 将筛选得到的菌株调节为OD600为1的菌悬液，按1%（V/V）接种量接种到含L-色氨酸（100 mg/L）的LB液体培养基中。于30℃、180 r/min的条件下，持续培养1 d。（1）定性测定［11］：纯化完成的菌株接种到含L-色氨酸（100 mg/L）的LB液体培养基中。于30℃、180 r/min的条件下置于摇床中，连续培养1 d。取50 μL菌悬液滴于白瓷板上，加入50 μL 50 mg/L的Salkowski比色液（50 mL 35% HClO4+1 mL 0.5 mol/L FeCl3）。将未接菌的LB液体培养基加入等量比色液作阳性对照。将白瓷板于避光环境内静置30 min后观察。如果溶液变红，则表明菌株能够分泌IAA。（2）定量测定［12］：将10 mL的菌悬液在10 000 r/min下进行离心，离心时间为10 min，收集2.5 mL的上清液，将未接菌的液体培养基作空白对照，处理与对照均与等量Salkowski比色液混合，避光静置30 min，测定530 nm下的吸光度值。同时设置不同浓度梯度的IAA标准溶液（0、10、20、30、40、50、60 μg/mL），比色步骤同上，据标准曲线计算待测液IAA浓度。

1.2.1.3 菌株溶磷解钾能力的测定 将得到的产IAA菌株制成OD600为1的供试菌悬液，以1%（V/V）接种于含50 mL有机磷液体培养基和解钾液体培养基的250 mL三角瓶中。30℃，180 r/min培养2 d。取培养液20 mL，6 000 r/min离心20 min，分别用钼蓝比色法和火焰分光光度法测定有机磷液体培养基和解钾液体培养基上清液中的磷［13］、钾含量［14］。

1.2.2 多功能促生菌的鉴定

1.2.2.1 形态学鉴定 筛选得到的菌株接种于LB液体培养基，30℃培养1 d。观察单个菌落的透明度、大小、颜色、形状等形态特征。革兰氏染色后，用显微镜观察菌株形态［15］。将菌株接入液体培养基，37℃，180 r/min振荡培养12 h，通过冷冻干燥法制成电镜样品，进行电镜（日立S-3400N）扫描观察［16］。

1.2.2.2 生理生化指标鉴定 革兰氏染色、好氧性测试、接触酶检测、甲基红（M.R）试验、二乙酰（V-P）试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、硝酸盐还原试验及柠檬酸盐利用试验等试验方法参照《常见细菌系统鉴定手册》［15］。

1.2.2.3 16S rDNA分子学鉴定 将多功能促生菌在LB液体培养基中培养至对数生长期后，离心收集，使用SDS-CTAB法提取其总DNA［17］，以27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）为PCR扩增引物。PCR产物交由上海英俊生物工程有限公司进行测序，在GenBank中Blast比对测序得到16S rDNA序列的同源序列，以邻接法（Neighbor-Joining）在MEGA 7.0软件中构建系统发育树，并在NCBI上申请登录号。

1.2.3 菌株促生条件优化 在无机盐培养基中添加L-色氨酸（100 mg/L），并通过调节不同参数来优化培养条件。这些参数包括初始pH（4、5、6、7、8、9、10）、装液量（25、50、75、100、150）、碳源（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、甘露醇、果糖）以及氮源（硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、谷氨酸、尿素、蛋白胨）。将OD600为1的菌悬液1%（V/V）接种。接种后，在30℃、180 r/min的条件下培养1 d，测定生长情况（OD600）。同时，使用上述IAA定量测定方法来评估培养基中IAA的含量。

1.2.4 盆栽试验 玉米盆栽试验于河南农业大学温室（郑州）进行，收集0-20 cm土层的砂质潮土样品，去除落叶、小石块等杂质，并经过5 mm筛，每盆装入1.5 kg土样。20%双氧水消毒玉米种子表面20 min，使用无菌水进行多次冲洗。于恒温恒湿（温度25℃、湿度90%）条件下催芽，选取长势一致的幼苗，移植到土壤中，每盆一株。将菌悬液在4 000 r/min下离心10 min，去除上清液。再利用无菌水重悬，反复离心重悬3次，将菌体溶于无菌水中，制成1011CFU/mL的菌水剂。以108CFU/g接种量接种于盆栽土壤，无菌水作为对照，单个处理重复6盆，以60%田间持水量为标准调整土壤含水量，定时浇无菌水保持。于种植30 d后采样。

用高效液相色谱（HPLC）法测定土壤IAA含量［18］。用钼蓝比色法［19］和火焰分光光度法［19］分别测定速效磷和速效钾含量。采集植株样品测定相对叶绿素含量（soil and plant analyzer develotrnent，SPAD）、鲜重、株高、植株全氮磷钾含量［19］。采集样本当天，用根系扫描仪（V700 PHOTO，Epson，日本）和图像分析软件（WinRHIZOTM2003b，加拿大）测总根长（total root length，RL）、根表面积（root surface area，RSA）、根体积（root volume，RV）、根平均直径（root average diameter，RD）、根尖数（root tips，RT）、根分枝数（root forks，RF）和根系构型分级参数。据根系直径（RD，mm）对RL、RSA和RV进行区间等级定义：I级：RD 0.0-0.5 mm；II级：RD 0.5-1.0 mm；III级：RD 1.0-1.5 mm；IV级：RD＞1.5 mm［20］。

1.2.5 田间试验 试验在农业农村部华北小麦玉米轮作营养与施肥科学观测实验站进行，供试土壤为砂质潮土，土壤理化性状见表1，小麦品种为矮抗58。小麦基施复合肥（N∶P2O5∶K2O = 15∶15∶15）600 kg。将制成的以骨粉为载体的YM3菌剂（有效活菌数1011CFU/g）按40 kg/hm2施用，每处理重复3次。拔节期时开沟追施尿素120 kg/hm2。随机区组划分，设置10个小区，每个小区面积为18 m2。在小麦成熟期，取1 m双行的穗数，随机选20株小麦测定有效穗数、穗粒数、千粒重、成熟期地上部生物量，计算小麦产量。通过五点取样法，采集0-20 cm土层土样，测定土样中pH、IAA、有效氮、速效磷、速效钾含量，具体测试方法同盆栽试验。

于小麦收获后进行夏玉米播种，供试玉米品种为豫单9953，玉米行距60 cm，株距27 cm。玉米基施上述复合肥650 kg/hm2，不追肥。在玉米播种期常规施肥基础上施用同种微生物菌剂，采用与小麦季相同的施用方式和施用量。每处理重复3次，设置10个小区，随机区组划分，单个小区的面积为50 m2。在玉米收获期，取2 m双行的穗数，随机选取3株玉米测行粒数、穗粗、穗长、穗行数、百粒重、单穗重、穗秃顶长，计算玉米产量。通过五点取样法，采集0-20 cm土层土样。测定土样中pH、IAA、有效氮、速效磷、速效钾含量，具体测试方法同盆栽试验。

1.2.6 数据统计与分析 试验所得数据采用Microsoft Office 2020、SPSS 23.0统计，Origin 2021和Metabo Analyst作图，单因素方差分析采用LSD法检验处理间的差异显著性（P＜0.05），相关性通过Pearson相关性分析。

2 结果

2.1 多功能促生菌的筛选

从玉米根际分离筛选出16株细菌，命名为YM1-YM16，对这16株菌的各项促生能力进行定量评估发现，其中菌株YM3兼具产IAA、溶有机磷、解钾能力，其产IAA能力可达到59.21 mg/L，对有机磷的转化量达0.72 mg/L，对钾长石粉的转化量达18.56 mg/L。

2.2 促生菌形态及生理生化特性鉴定

通过平板划线法得YM3单菌落，YM3菌落不规则排列，不透明，暗黄色，表面粗糙，褶皱，边缘粗糙（图1-A）。革兰氏染色阳性，菌体呈杆状（图1-B）。菌体大小为（2.42-3.67）μm×（0.63-0.89）μm（图1-C）。YM3为兼性厌氧菌，除甲基红（M.R）反应为阴性外，其他生理生化指标皆为阳性（表2）。

图1 YM3的菌落图（A），革兰氏染色图（B）及电镜图（C）Fig. 1 Colony diagram（A）, gram staining diagram（B）and electron microscope diagram（C）of YM3 strain

表2 YM3菌株的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of YM3 strain

据16S rDNA的测序结果和 GenBank 已登录的核苷酸序列进行同源性比较，菌株YM3与Bacillus subtilis JCM 1465（NR113265）同源性达99%，N-J方法构建YM3的16S rDNA系统发育树（图2）。综合菌株形态与生理生化特征，鉴定菌株YM3为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），将序列上传NCBI，获得登录号KP743130。

图2 YM3菌株16S rDNA序列的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of YM3 strain

2.3 不同培养条件对菌株促生能力的影响

不同培养条件对YM3产IAA能力的试验结果表明，pH为4和10时YM3基本不生长，pH为5-9时，IAA产量较稳定，维持在61.80 mg/L上下（图3-A）。通气量随装液量增加而减少，装液量为25 mL/250 mL时，YM3产IAA量达顶峰，峰值为65.17 mg/L（图3-B）。以麦芽糖为碳源时，菌体产IAA能力达到65.69 mg/L（图3-C）。以蛋白胨为氮源时，菌体产IAA能力达到64.56 mg/L（图3-D）。

图3 不同培养条件下YM3菌株的产IAA能力和生长状况（OD600）Fig. 3 IAA-producing ability and growth status（OD600）of YM3 strain under different cultural conditions

2.4 多功能促生菌剂在玉米盆栽试验中的促生效果

与对照处理相比，接种YM3菌水剂使土壤IAA、速效钾、速效磷分别显著增加75.00%、20.00%，48.66%（图4）。YM3显著增加了玉米幼苗的RL、RSA、RV、RT和RF，分别增加了67.95%、59.21%、51.13%、71.34%和92.06%。此外，YM3还显著提高了I级径级（RD 0.0-0.5 mm）区间的RL（72.48%），RSA（59.47%）和RV（65.29%）。因此，施加YM3明显促进了根系的生长（表3）。施加YM3后玉米鲜重、SPAD、全磷、全钾、株高、全氮显著提高了39.86%、18.27%、52.26%、36.53%、23.51%、17.68%（图5）。

图4 接种菌株YM3培养30 d后土壤IAA及速效钾、速效磷含量Fig. 4 Soil IAA, available potassium, and available phosphorus contents after 30 d of inoculation with strain YM3

图5 接种菌株YM3对玉米幼苗生长状况和养分含量的影响Fig. 5 Effects of inoculation with strain YM3 on the growth status and nutrient content of maize seedlings

表3 接种菌株YM3对玉米幼苗根系结构和根系分级的影响Table 3 Effects of inoculation with strain YM3 on the root system structure and root classification of maize seedlings

2.5 玉米幼苗及土壤中各指标之间的主成分分析、热图分析以及相关矩阵

PC1和PC2在幼苗和土壤指标的整体变异中分别占了68.9%和21.6%（图6-A）；CK和YM3处理显著分离（图6-B）；PC1和PC2同时显著影响了植物全氮、SPAD、株高、植株钾、鲜重、根尖数、根表面积、根体积、植株磷、土壤IAA、速效磷钾、根分枝数、总根长、根长V级、根表面积V级、根体积V级（图6-C）。热图与相关性分析结果表明，土壤IAA、速效磷、速效钾均与总根长、根表面积、根体积、鲜重、株高、SPAD、植株全氮、植株全磷、根长I级、根表面积I级、根体积I级呈显著正相关（图7）。

图6 玉米幼苗及土壤中各指标之间的主成分分析Fig. 6 Principal component analysis between maize seedlings and soil indicators

图7 玉米幼苗与土壤中指标之间的相关性分析和热图Fig. 7 Correlation analysis and heat map among indicators in maize seedlings and soil

2.6 多功能促生菌剂在冬小麦-夏玉米轮作田间的促生效果

施YM3菌剂使小麦土壤有效氮、速效磷、速效钾含量显著提高了9.08%、13.78%、16.66%（图8-A）。小麦千粒重、有效穗数、成熟期地上部生物量分别显著提高了7.63%、78.47%、82.53%，总产量显著提高了42.18%（图8-B）。玉米土壤有效氮、速效磷、速效钾含量分别增加0.77%、19.18%、15.95%（图8-C）。玉米穗长、行粒数、单棒重分别显著增加了6.74%、22.15%、11.88%，穗秃顶长降低27.57%，总产量显著提高了13.22%（图8-D）。

图8 YM3对冬小麦夏玉米土壤理化性质及产量性状的影响Fig. 8 Effects of YM3 on the soil physicochemical properties and yield traits of wheat and corn

3 讨论

植物根际促生菌的应用对作物产量的提高有着至关重要的作用［21］。本研究在玉米根际土壤中筛选得到一株多功能促生菌株YM3，鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。芽孢杆菌属（Bacillus）是多种植物根际微生物群落的优势属［22-23］，已被应用于多种促生研究。Nunes等［24］发现枯草芽孢杆菌能够产生IAA，促进番茄（Solanum lycopersicum Linn）生长。王舒等［25］从油茶（Camellia oleifera Abel）根际分离出一株芽孢杆菌属的高效溶磷菌，溶磷率为19.75%。尽管芽孢杆菌在不同作物中有良好的促生效果，但目前的研究主要集中在筛选和验证菌株的某一项特定能力方面，兼具多功能的促生菌研究较少。本研究筛选到的菌株YM3兼具产IAA、溶有机磷、解钾功能，产IAA能力达59.21 mg/L。

菌株YM3在装液量为25 mL/250 mL时，产IAA量最多，随装液量升高，菌株IAA产量下降。徐文思等［26］发现了类似现象，其筛选得到的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）在装液量为50 mL时产IAA量最多，随后IAA产量随装液量增加而减少。推测是由于YM3为兼性厌氧菌，且IAA分泌为好氧代谢，装液量的提高使瓶内供氧量减少，YM3的生长和IAA代谢被抑制，导致IAA产量减少。

玉米盆栽试验中，接种YM3使土壤IAA、速效磷、速效钾含量显著增加。施加YM3菌剂使玉米幼苗的RL、RSA、RV、RT和RF分别显著增加67.95%、59.21%、51.13%、71.34%和92.06%。另外，YM3还显著提高了I级径级区间的RL（72.48%），RSA（59.47%）和RV（65.29%）。良好的根系特征是植物生长的关键［27］，IAA能控制根的伸长以及侧根的形成［28］。同时根系生长也与磷、钾密切相关，Niu等［29］研究表明，主根的伸长与磷含量直接相关。Tian等［30］研究显示，钾累积量与根长呈正相关。He等［31］同样发现了促生菌改良植物根系的现象，枯草芽孢杆菌通过刺激侧根形成，改善沙蒿（Artemisia desertorum Spreng）的根系。因此，施加YM3增加了土壤中速效磷、速效钾、IAA的含量，促进了玉米根系的生长，有益于吸收更多水分和营养成分以供给地上部，根系和地上部协同作用，进一步促进了植株的生长。

近年来PGPR研究取得了不少进展，但由于PGPR根际迁移机制复杂多样，PGPR野外效果难以重现［32］。为探究YM3在轮作大田中能否同样发挥较好的促生效果，在黄淮海平原冬小麦-夏玉米轮作体系的砂质潮土上进行了大田试验，结果表明：YM3菌剂处理后，轮作体系下小麦、玉米的产量分别显著提高了42.18%和13.22%。李刚强等［33］将两株固氮芽孢杆菌菌剂应用于小麦玉米轮作大田中，两种菌剂分别使小麦产量提高23.83%和13.84%，玉米产量提高9.30%和9.78%。相较而言，YM3在轮作体系中的增产率更高，可能由于YM3筛选自大田试验供试土壤，适应性较强。

前期研究表明，一些促生菌株不仅能够在原寄主植物的根际环境中生存，在其他种属植物的根际中也能发挥促生作用。Sapre等［34］从小麦根际得到一株克雷伯氏属（Klebsiella）的促生菌，将其应用在燕麦（Avena sativa Linn）生长中，得到了良好的促生效果。虽然促生菌在非寄主植物上的作用已得到广泛研究，但其在黄淮海平原小麦玉米轮作体系中的应用研究仍相对较少。本研究表明，筛选自玉米根际土的YM3菌株不仅在玉米盆栽试验中促生效果较好，而且在轮作制度下的土壤中适应性强，该多功能菌株在实际生产中具有广谱性。

YM3不仅增加了土壤中矿质营养元素的含量，其分泌的IAA还促进了作物根系生长，使作物能够更好地从土壤中汲取养分，促进植物生长。其在轮作制度下复杂的微生物环境中也能发挥作用，提高小麦和玉米的产量。有研究表明，枯草芽孢杆菌对多种植物病原体有拮抗作用［35-37］，其在轮作制度下的生防效果有待进一步研究。

4 结论

本研究筛选得到的一株枯草芽孢杆菌YM3，具有分泌IAA、溶有机磷和解钾的能力。接种YM3菌水剂使玉米盆栽土壤中IAA、速效磷、速效钾显著提高，根长、根表面积、根体积显著提高。根系构型的改善促进了玉米植株对养分的吸收，鲜重、株高、SPAD、全氮磷钾均显著提高。同时，接种YM3菌剂可显著提高小麦玉米轮作大田试验两种作物产量。本研究表明，接种YM3可使土壤肥力得到改善，小麦玉米轮作体系中作物产量得到提高。