响应曲面优化茶树花饮料发酵工艺

周 洁,刘忠英,范静怡,周倩倩,崔继来*

(1. 信阳师范大学a. 生命科学学院b. 河南省茶树生物学重点实验室, 河南 信阳 464000;2. 贵州省茶叶研究所, 贵州 贵阳 550000)

0 引言

茶树花是茶树生长过程中重要的副产物,长久以来被认为是茶叶生产过程中的“废料”。茶树花年产量约为3000～12 000 kg/hm2,因此我国每年能收获超过40 亿kg的茶树花,并且去除茶树花能提高第二年茶叶的产量和质量[1]。随着研究的深入,人们发现茶树花不仅具有令人愉悦的挥发性物质[2-3],且所含挥发性物质的种类多于茶叶[4]。梅鑫等[5]从白色茶树花和紫色茶树花中共鉴定出152种挥发性代谢物。陈丽华等[6]从秋季茶树花中鉴定出45种香气组分。茶树花中有些挥发性物质的含量高于茶叶,如1-苯基乙醇在茶树花中富集,而在茶叶中微量存在[4]。茶树花中还含有很多与茶叶相似的生物活性成分,如茶多酚[7-8]、茶多糖[9-10]、氨基酸[1, 11-12]等。茶树花中含有和茶叶中含量相当的茶多酚[11, 13],但不同品种茶树花之间差异较大[14]。研究者还发现水解单宁[15]、茶皂苷[16]、茶多糖[17]、有机酸和氨基酸[18]等生物活性成分在茶树花中的含量高于茶叶。如茶树花中可溶性糖和可溶性蛋白质含量丰富,是茶叶中含量的数倍[19]。茶树花中甜味氨基酸含量比例最高,鲜味氨基酸含量随着开花程度而逐渐升高,苦味氨基酸含量则以花蕾期为最高,开花期最低[20]。这些物质具有保护肠胃[21]、降血糖[22]、降血脂[23]、抗氧化[24]、抗炎[25]、抗癌[26-28]等功效。药理学实验还表明,茶树花提取物对正常细胞没有毒性[29]。因此,茶树花具有作为茶树第二资源开发利用的潜力。2013年卫生部批准茶树花为新资源食品,2014年中国国际茶树花研发中心在浙江大学成立。目前,关于茶树花开发利用的研究已有不少,分布在食品[30-33]、医药[34-35]、保健品以及日化品[36]等相关行业。

2007年日本率先研发出茶树花饮料[37]。截止2020年12月,在中国知网上查询关于茶树花的专利共有152项,其中涉及茶树花饮料的有25项,但未见有单独研究茶树花饮料的。本文在已有研究的基础上,仅以茶树花作为研究对象,参照其他果树植物的发酵工艺[38-42],从酵母菌、乳酸菌、双歧杆菌中寻找最优菌种,进行单因素实验,再通过响应曲面试验设计,对发酵工艺参数进行优化,获得风味最佳的茶树花发酵饮料。通过分析发酵饮料中主要生化成分的含量及抗氧化能力,对茶树花发酵饮料进行综合评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶树花,2018年冬季采摘于贵州省湄潭县京贵茶树花产业发展有限公司的茶园基地,烘干待用;白砂糖,市售;安琪高活性干酵母,安琪酵母股份有限公司;川秀乳酸菌、川秀双歧杆菌,北京川秀科技有限公司。

甲醇、乙腈(色谱级),美国TEDIA试剂公司;冰乙酸(色谱级),天津市大茂化学试剂厂;没食子酸(Gallate,GA)标准品、儿茶素(Catechin,C)标准品、表儿茶素(Epicatechin,EC)标准品、表没食子儿茶素(Epigallocatechin,EGC)标准品、表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallic acid ester,ECG)标准品、表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG) 标准品、茶氨酸标准品、咖啡碱标准品,中国计量科学研究院;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH),福州飞净生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

VIS-7220型可见分光光度计,北京瑞利分析仪器有限公司;安捷伦1260型高效液相色谱仪,美国安捷伦科技公司;LMQ C-50E型高压灭菌锅,山东新华医疗器械股份有限公司;LK-69SNJ型酸奶机,河南绿科电器科技有限公司;KQ-1000KDE型高功率数控超声清洗仪,昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程及操作要点

茶花→粉碎→浸提→抽滤→调味→杀菌→接种→发酵→发酵饮料。

粉碎:植物粉碎机粉碎,过筛;浸提:100 ℃超声浸提10 min;抽滤:趁热真空抽滤得到滤液并定容;调味:浸提液冷却后,加入白砂糖,调节味道;杀菌:脱脂棉封口,置于高压灭菌锅内,120 ℃灭菌30 min;接种:浸提液灭菌后冷却,加入0.5 g酵母粉,接种量0.25%;发酵:将接种后的浸提液封口,放入发酵箱中恒温发酵。

1.3.2 单因素实验

菌种的选择:根据预实验,料液比1/50 g·mL-1,加糖量6%,分别加入0.25%酵母菌、乳酸菌、双歧杆菌,在40 ℃下发酵40 h,感官评价获得最优菌种。

料液比的选择:调整料液比分别为1/30、1/40、1/50、1/60、1/70 g·mL-1,加糖量6%,加入0.25%的乳酸菌,在40 ℃下发酵40 h,感官评价获得最优料液比。

加糖量的选择:料液比1/60 g·mL-1,调整加糖量分别为4%、5%、6%、7%、8%,加入0.25%的乳酸菌,在40 ℃下发酵40 h,感官评价获得最优加糖量。

发酵温度的选择:料液比1/60 g·mL-1,加糖量6%,加入0.25%的乳酸菌,调整发酵温度分别为30、35、40、45、50 ℃,发酵40 h,感官评价获得最优发酵温度。

发酵时间的选择:料液比1/60 g·mL-1,加糖量6%,加入0.25%的乳酸菌,发酵温度35 ℃,调整发酵时间分别为20、30、40、50、60 h,感官评价获得最优发酵时间。

1.3.3 响应曲面优化

在单因素实验的结果上,以料液比(A,g·mL-1)、加糖量(B,%)、发酵温度(C,℃)、发酵时间(D,h)为自变量,以审评得分为响应值,根据中心组合试验设计(Central Composite Design,CCD),采用Design-Expert 12软件进行4因素5水平的响应曲面试验设计,设计水平编码见表1。

表1 中心组合试验因素与水平

1.3.4 成分分析

按照《GB/T 8313—2018 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》进行茶多酚、儿茶素、咖啡碱测定。(1)茶多酚的测定:吸取发酵液1 mL,加入5.0 mL 10%福林酚试剂摇匀,反应5 min,然后加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液,室温下放置60 min,于765 nm处测得吸光度,同时建立基于没食子酸的茶多酚定量标准曲线计算茶样中茶多酚含量。(2)儿茶素、咖啡碱的测定:吸取饮料成品过0.45 μm无机滤膜,采用高效液相色谱分析儿茶素和咖啡碱含量。

采用《GB/T 8314—2013 茶游离氨基酸总量的测定方法》进行游离氨基酸测定。吸取发酵液1 mL注入25 mL比色管,加入0.5 mL pH8.0磷酸缓冲溶液和0.5 mL 2%茚三酮溶液,在沸水浴中加热15 min,冷却后加水定容至25 mL。放置10 min后于570 nm处测得吸光度,以空白试剂为参比测定吸光度后,对比标准曲线得出茶叶中游离氨基酸的含量。

自由基清除率(R)测定,用无水乙醇配置0.2 mmol/L的DPPH溶液,将发酵液稀释2倍作为供试液。吸取供试液5 mL,加入0.2 mmol/L的DPPH溶液5 mL,摇匀后,于黑暗处放置30 min,在517 nm处测得A样品吸光值(xA样品);吸取供试液5 mL,加入无水乙醇5 mL,在517 nm处测得A空白吸光值(xA空白);吸取0.2 mmol/L的DPPH溶液5 mL,加入无水乙醇5 mL,在517 nm处测得A对照吸光值(xA对照)。

1.3.5 色谱条件

采用安捷伦C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×50 mm),流速保持1 mL/min,检测波长为278 nm,进样量为10 μL,流动相A(乙腈90 mL+10 mg/mL EDTA-2Na 2 mL+冰乙酸20 mL定容至1000 mL);流动相B(乙腈800 mL+10 mg/mL EDTA-2Na 2 mL+冰乙酸20 mL定容至1000 mL)。洗脱梯度:100% A相保持18 min,至25 min期间匀速降低至68%,保持10 min,结束。

1.3.6 评分标准

参照茶叶审评的国家标准,邀请5位感官审评人,根据表2对茶树花发酵饮料的色泽、香气、滋味、质地进行感官审评,色泽2.5分、香气2.5分、滋味3分、质地2分,总分10分,最后取平均分。

表2 感官审评打分表

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 菌种的选择

设定料液比1/50 g·mL-1、加糖量6%,灭菌后,分别加入0.25%酵母菌、乳酸菌、双歧杆菌,40 ℃下发酵40 h,进行感官审评。

由表3可知,酵母菌组色泽黄亮澄清,有明显酒精味,入口酸苦、辛辣,质地均匀,口感不好,与研究团队另一组研究结果相吻合[40],综合得分3.8分。乳酸菌组花香中带甜香,且有明显茶香,滋味较浓、尚醇,有回甘,质地均匀,综合得分7.4分。双歧杆菌组花香中带甜香,茶香淡薄,滋味淡、苦涩味重,质地均匀,综合得分6.7分。不同菌种对茶树花发酵液影响为乳酸菌>双歧杆菌>酵母菌,乳酸菌发酵产品色泽红亮、香气较好、滋味浓、尚醇、质地均匀,综合得分最高。因此选取乳酸菌作为最佳发酵菌种。

表3 不同菌种对感官评价得分的影响

2.1.2 料液比的选择

不同料液比组合实验的发酵液色泽均为红亮带棕,料液比为1/60 、1/70 g·mL-1时,色泽更加透亮。料液比1/30 、1/40 g·mL-1时,香气过于浓郁,让人不适,滋味较苦涩;料液比1/50 g·mL-1时香气适宜,滋味略苦涩;料液比1/60 g·mL-1时香气适宜,滋味微甜适中,口感最好,综合得分最高;料液比1/70 g·mL-1时香气、滋味较淡薄。因此选取料液比1/60 g·mL-1作为最佳料液比(图1)。

图1 发酵条件对发酵产品感官审评得分的影响

2.1.3 加糖量的选择

不同加糖量的发酵液颜色均为红棕色透亮,随着加糖量的增加,香气和滋味中的甜味逐渐增强,在8%时呈现过甜偏腻。加糖量为6%时,香气为甜花香带茶香,滋味尚醇、浓厚度适中,口感最佳。因此选取6%作为最佳加糖量(图1)。

2.1.4 发酵温度的选择

发酵温度对发酵液色泽没有明显影响。发酵温度较低,发酵液香气为甜花香,涩味较重;发酵温度偏高,甜香、花香均有所减弱,滋味淡薄。在发酵温度为35 ℃时,发酵液色泽红棕透亮,甜花香带茶香,滋味尚醇、甜度适中,口感最佳,综合得分最高。因此选取35 ℃作为最佳发酵温度(图1)。

2.1.5 发酵时间的选择

发酵时间较短时,甜香明显,花香淡,发酵液涩味重,滋味协调度差;延长发酵时间能改善香气、滋味;发酵60 h时,香气变淡,滋味尚好。在发酵40 h和50 h时能得到较好的发酵饮料,发酵40 h综合得分最高。因此选取40 h作为最佳发酵时间(图1)。

2.2 响应面优化结果

根据单因素实验最佳条件,以料液比1/60 g·mL-1、加糖量6%、发酵温度35 ℃、发酵时间40 h为中心点,试验设计与结果如表4所示。

表4 中心组合试验设计与结果

将表4的结果通过Design-Expert 12软件进行多元回归拟合,得到审评得分(Y)的二次多项回归方程为:

Y=-66.002 9+0.494 6A+3.635 4B+

1.674 2C+0.426 7D+0.003 1AB-

0.003 8AC-0.000 3AD-0.021 3BC-

0.006 3BD-0.000 0CD-0.003 6A2-

0.109 9B2-0.017 1C2-0.004 0D2。

表5是方差分析表。从表5可知,该回归模型极显著(P<0.01),失拟项不显著(P=0.1257>0.05)。该二次模型多元相关系数R2=0.972 0,调整决定系数R2=0.944 0,预测R2=0.841 2,说明该模型拟合度较好,能较好地反映试验结果。A、B、D、AC、BC、A2、B2、C2、D2的P值小于0.01,表明料液比、加糖量、发酵时间、料液比与发酵温度、加糖量与发酵温度之间的交互作用对审评得分的影响极显著。BD的P值小于0.05,表明加糖量和发酵时间之间的交互作用对审评得分的影响显著。根据F值,单因素对茶树花饮料发酵的审评得分影响次序为A>B>D>C。

表5 回归模型方差分析

图2分别是四因素两两交互作用对茶树花发酵液审评得分的三维响应面图,直观反映了各因素间的相互作用。

注：a)料液比与加糖量;b)料液比与温度;c)料液比与时间;d)加糖量与温度;e)加糖量与时间;f)温度与时间

以感官评价得分为响应值,在优化试验结果基础上,利用Design-Expert软件得到的最佳组合条件为料液比1/53.7 g·mL-1、加糖量6.4%、发酵温度35.1 ℃、发酵时间41.4 h。在此基础上的理论感官评价得分可达到8.7分。根据实际情况优化后的最佳发酵条件为料液比1/54 g·mL-1、加糖量6.5%、发酵温度35 ℃、发酵时间41.5 h。

注：**为差异极显著,P<0.01;*为差异显著,P<0.05。

2.3 优化结果的验证

2.3.1 感官评价得分结果分析

对最佳优化结果进行验证,得到的三组发酵饮料感官评价得分分别是8.7、8.7、8.6分,平均审评得分为8.7分,与预测值8.7吻合,说明得到的回归模型和实际情况拟合度较好。

2.3.2 成分测定结果分析

采用国家标准中茶树相关成分的检测方法,对茶树花发酵液发酵前后的几种主要成分进行定量分析,发现游离氨基酸含量由1.91%上升到2.15%,咖啡碱含量由0.59%下降到0.52%,茶多酚含量由5.85%下降到5.06%,儿茶素总量由1.46%下降到1.26%,DPPH自由基清除率由发酵前的91.89%下降到85.47%。

3 结束语

茶树花中含有与茶叶相同的化合物,与直接饮茶相比,茶树花发酵饮料有明显的茶香、花香和甜香。茶树花中天然含有的多酚类物质和挥发性物质,为研究茶树花饮料提供了坚实的基础,是提升茶树花附加值的一个先天优势。

本研究以茶树花作为原料,通过相应曲面法优化发酵工艺,得到最佳发酵工艺为料液比1/54 g·mL-1、加糖量6.5%、发酵温度35 ℃、发酵时间41.5 h。在此工艺条件下,茶树花饮料感官品质最佳。通过对比茶树花发酵液发酵前与发酵后几种主要有效成分含量,发现游离氨基酸含量略有升高,咖啡碱含量略微下降,茶多酚、儿茶素总量在发酵前后均有下降,与DPPH抗氧化测定结果一致。这些变化表明在茶树花发酵液保持原有功能活性的基础上,发酵工艺对茶树花饮料的滋味有改善作用,但是变化的机制以及新形成的产物需要进一步研究。综上,本研究优化了茶树花发酵工艺,为茶树花的进一步开发利用提供了一定理论依据。