基于网络药理学探讨栀黄止痛散治疗类风湿性关节炎作用机制及实验验证

2024-02-04田晓云杨莹洁郑婉婷黄鸣清赵海誉南丽红陈剑钰

中国药理学通报 2024年2期

田晓云,杨莹洁,郑婉婷,黄鸣清,赵海誉,南丽红,陈剑钰

(1.福建中医药大学药学院,福建福州 350122;2.中国中医科学院中药研究所,北京 100700)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性自身免疫性疾病,临床表现为关节疼痛、僵硬及肿胀,属于中医“痹症”的诊疗范畴。该病发病人群广、发病率高、治疗周期长且致残率高。近年来,中药复方在干预、治疗RA取得较好效果,因此,具有巨大潜力。研究表明,益肾清络活血方可通过抑制炎症反应,降低炎症评分及血清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β (interleukin-1 beta,IL-1β)的表达,升高OPG/RANKL的比值来调节关节骨破坏的环境,进而缓解RA病情[1];甘草养阴汤抑制大鼠成纤维滑膜细胞增殖,从而抗炎[2];断藤益母汤可通过下调VEGF信号通路抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)的增殖、迁移、黏附和血管形成,减轻RA血管翳的形成[3];四妙勇安汤合白虎汤加味可以抑制可溶性髓样细胞触发受体-1(triggering receptor expressed on myeloid cells 1,sTREM-1)、白细胞介素32(interleukin 32, IL-32)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase, GPI)等炎症介质的表达,减轻RA软骨炎症损伤[4]。

栀黄止痛散(Zhi-Huang-Zhi-Tong powder,ZHZTP)是全国名老中医王宏坤教授参考《诚书》栀黄散所得的经验加减方,由栀子、大黄、姜黄、黄柏、天花粉、赤小豆、赤芍、白芷、木香、冰片组成,其中栀子、大黄破瘀通脉、消肿散结为君药;天花粉、姜黄、黄柏可以加强活血化瘀之功为臣药;赤小豆、赤芍、白芷、木香行气利水消肿,冰片开窍通络,引领诸药,促使药物的吸收,是为佐使。ZHZTP的功效为清热解毒、逐瘀通经、消肿止痛,临床在关节扭伤、骨关节炎、关节滑膜炎等方面具有较好的治疗效果。王铭增等[5]研究表明,使用ZHZTP治疗急性痛风性关节炎患者,可显著降低血清炎性因子、C-反应蛋白(c-reactive protein,CRP)、血清尿酸(serumuric acid,UA)的水平,减轻患者疼痛;齐秀春等[6]发现,ZHZTP能够减轻机体胶原纤维损伤、拮抗损伤局部过氧化反应,缩短急性踝关节扭伤患者疼痛时间;温阳阳等[7]发现,ZHZTP可明显降低IL-1β、TNF-α等炎性因子水平,促进痛风患者关节肿胀消退。可见,ZHZTP在临床上治疗各类关节炎疾病具有较好效果,然而其有效成分、作用机制、以及是否对RA具有治疗效果尚无报道。

网络药理学是一种多学科交叉、通过整体生物网络分析探讨药物,尤其是复杂中药,作用于疾病机制的研究方法,能快速挖掘药物与作用靶点间的相互关系、揭示中药活性成分间的协同作用[8]。本文运用网络药理学方法探讨ZHZTP化学成分、作用靶点及信号通路,挖掘其治疗RA的可能作用机制并进行体外细胞实验验证,为临床治疗及后期临床前研究提供理论依据,具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 网络药理学初步探索

1.1.1栀黄止痛散活性成分及靶点预测利用TCMSP数据库( https://old.tcmsp-e.com/index.php)检索ZHZTP君臣药(栀子、大黄、姜黄、黄柏、天花粉)的化学成分及相应靶点蛋白,另外,将相应靶点蛋白名称用uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)转化为其基因名。

1.1.2RA疾病靶点获取 Genecards数据库(https://www.genecards.org/),OMIM数据库和TTD数据库,综合汇总RA疾病发病过程中重要靶点。

1.1.3栀黄止痛散活性成分关系分析将RA疾病相关靶点与中药活性成分的作用靶点取交集,获得交集靶点导入STRING数据库(https://string-db.org/),Cytoscape3.8.2软件作图分析Network Analysis功能计算出节点的degree,betweenness、closeness值,并取以上3项均大于平均值的靶点,确定参与调控的核心靶点,并进行蛋白-蛋白网络关系(PPI)网络分析。

1.1.4构建“药物-成分-靶点”网络 Cytoscape3.8.2软件绘制“药物-成分-靶点”网络图,以网络中的节点和边表示各因素之间的关联性。利用软件中的“Network Analyzer”功能对“药物-成分-靶点”网络进行分析,选取degree、betweenness及closeness大于平均值的成分,从而分析通过作用RA重要靶点发挥治疗作用的各单味药之间、单味药与成分的关联性,进而阐明ZHZTP的药效物质基础。另外,也可提示ZHZTP中重要化学成分与重要靶点的关联性,从而推测ZHZTP可能的作用机制。

1.1.5GO和KEGG通路富集分析将“1.3”结果中的交集基因通过DAVID数据库进行GO和KEGG分析,从而确定ZHZTP所调控的信号通路及所涉及的相关分子功能。

1.1.6关键成分与核心靶点的分子对接验证取Cytoscape3.8.2软件分析“药物-成分-靶点”关联性中degree排名前3的靶点,确定其为ZHZTP治疗RA的核心靶点。使用AutoDock vina软件,将关键活性成分与上述核心靶点进行分子对接,确定其结合作用及结合位点,结果用pymol软件展示。

1.2 体外验证

1.2.1主要试剂与仪器试剂:TNF-α(AF-300-01A),PeproTech公司;噻唑蓝(0793-1),Lablead 公司;胎牛血清(FBS,10099-141)Gibco公司;青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin Solution,15140122),Gibco公司;DMEM 基础培养基(11965-092),Gibco公司;β-actin(P31029),北京全式金生物公司;PI3K(154598) ,Abcam公司;AKT(4691S),Cell Signaling Technology公司;m-TOR(2983S)抗体,Cell Signaling Technology公司; 鼠二抗(SA00001-1),Proteintech公司;兔二抗 (SA00001-2),Proteintech公司。

仪器:ALPHA1-2 LD plus冷冻干燥机(德国Christ公司); 552BR138222 型电泳仪,71BR13865 型化学发光成像仪(美国 Bio-Rad 公司); 30174782 型多功能酶标仪(美国 Bio-Tek 公司); AS2000倒置生物显微镜(Motic公司)。

1.2.2栀黄止痛散冻干粉的制备及含量测定 ZHZTP由大黄30 g,天花粉20 g,黄柏20 g,栀子15 g,赤芍15 g,白芷15 g,赤小豆15 g,姜黄15 g,木香15 g,冰片10 g组成,均购自福建省第三人民医院,按常规中药煎煮法制备并浓缩,将浓缩液平铺于100 mm的培养皿中,置-80 ℃冰箱预冷过夜。将培养皿放入冷冻干燥机进行冻干,48 h后将冻干粉快速捻匀后放入50 mL离心管中,储存于-20 ℃备用。按2020版《中国药典》栀子、大黄项下含量测定方法检测,ZHZTP冻干粉中熊果酸含量为0.34%,大黄素含量为0.023%。

适量冻干粉加入二甲亚砜(DMSO)配制质量浓度为50 g·L-1的ZHZTP母液,使用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌,于-80 ℃冰箱保存。实验时提前解冻母液,用培养基对母液进行稀释,获得不同实验所需药物浓度,药物最大浓度的含药培养基中DMSO的浓度<1%。

1.2.3细胞培养 HUVECs购自ATCC公司,用含10% FBS、1% PS的DMEM高糖培养基,在37 ℃,5% CO2条件下培养。培养皿细胞在倒置显微镜下观察,根据细胞的状态、密度,进行换液、传代培养、冻存、复苏或者种板等操作,其中4～6代细胞进行实验。

1.2.4MTT检测HUVECs活力将HUVECs以5×103个/孔的密度接种于96孔板,培养至细胞对数生长期。分别以浓度为0、15.6、31.3、62.5、125、500 mg·L-1ZHZTP孵育细胞,各剂量组均设3个复孔。24 h后弃去上清,每孔加入100 μL MTT(5 g·L-1)工作液,继续培养4 h后用酶标仪测定在490 nm处的吸光度A,并计算细胞活力,每次实验重复3次,取均值进行统计分析。

确定给药浓度范围后,分别设置空白组、模型组(基于课题组前期研究TNF-α 20 μg·L-1)、ZHZTP低、中、高剂量治疗组(12.5、25、50 mg·L-1),按照上方法进行检测,计算细胞活力,每次实验重复3次,取均值进行统计分析。

1.2.5平板划痕实验检测HUVECs迁移情况平板划痕实验,即伤口愈合实验(wound-healing assay),在融合的单层细胞上制造一个空白区域,称为“划痕/伤口”,边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕/伤口”愈合。因其类似体外伤口愈合过程,广泛用于观察药物、基因等外源因素对细胞迁移和修复的影响。用marker笔在24孔板背后,以直尺均匀划横线,大约每隔0.5～1 cm/道,横穿过孔,根据3.4结果,设置空白对照组、模型组(TNF-α 20 μg·L-1)、ZHZTP低、中、高剂量治疗组(12.5、25、50 mg·L-1)。在每孔中加入HUVEC约5×104个,过夜待细胞铺满,加入无血清培养基饥饿12 h,以排除细胞增殖的影响。用10 μL枪头垂至于背后的横线划痕,用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入无血清培养基,ZHZTP低、中、高剂量治疗组依次加入(12.5、25、50 mg·L-1)ZHZTP预处理2 h,模型组和ZHZTP治疗组分别加入TNF-α(20 μg·L-1),放入37 ℃,5% CO2培养箱培养。按0、12 h取样,每个样本选取3个视野,拍照。使用ImageJ软件进行处理,取均数进行统计学分析,实验重复3次。愈合率=(各处理组0 h面积-12 h面积/各处理组0 h面积)×100%。

1.2.6Western blot检测HUVECs中部分关键靶点的表达将HUVEC细胞以30×104个/孔的密度接种于6孔板,培养至细胞对数生长期,分组给药参照3.5。给药24 h后,收集细胞,加细胞裂解液50 μL,冰上充分裂解30 min,4 ℃,12 000 r·min-1,10 min,收集上清液,采用BCA试剂盒定量蛋白浓度,10% SDS-PAGE胶电泳分离蛋白,冰上转膜80 min。转膜结束,5%脱脂奶粉封闭2 h,加入一抗PI3K(1 ∶1 000)、AKT1(1 ∶1 000)、m-TOR(1 ∶1 000) 和β-actin(1 ∶1 000),4 ℃孵育过夜。除去一抗后,按要求分别加入鼠二抗(1 ∶3 000)、兔二抗(1 ∶3 000)室温孵育2 h。最后ECL化学发光显影,采集图像,并分析灰度值。

2 结果

2.1 网络药理学分析结果

2.1.1栀黄止痛散有效活性成分及作用靶点筛选结果通过TCMSP数据库分析并筛选ZHZTP有效成分共116个,并通过TCMSP分析此116个活性成分的靶点信息,用Uniprot数据库转化为基因名,去重后得到242个靶点。

2.1.2RA疾病靶点筛选结果综合GeneCards数据库、OMIM数据库和TTD数据库,去重后汇总共得RA相关靶点共1 364个。将RA相关靶点(1 364个)与TCMSP分析得到的ZHZTP靶点(242个)取交集,得到共有靶点93个(如Fig 1)。

2.1.3“药物-成分-靶点”网络关系利用Cytoscape3.8.2软件绘制ZHZTP治疗RA的“药物-成分-靶点”网络图(Fig 2)。图中节点表示药物或成分或靶点因素,边表示不同因素之间的关联性;节点的面积越大,颜色越深,表示该因素重要性越高;连线的颜色越深,表示该因素与其他因素的关联性越强;网络中共包括471个节点和1 821条边。将“成分-靶点”分析结果中Degree排序筛选前3得到靶点AKT1、TNF和IL-6(Tab 1),推测它们可能是ZHZTP治疗RA的核心靶点。作用RA相关靶点的单体成分中熊果酸、大黄素的degree值明显高于其它成分,在“药物-成分-靶点”网络图中占据成分的核心地位,表明这两个成分与RA重要靶点密切相关,可能是ZHZTP治疗RA的主要活性成分。另外,通过“药物-成分”分析发现熊果酸、大黄素分别属于君药栀子、大黄中的重要成分。

Fig 1 Intersection of predicted targets of Zhi-Huang-Zhi-Tong powder and RA

Tab 1 Hub targets regulated by Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA treatment

2.1.4GO和KEGG通路富集分析将RA相关靶点与ZHZTP靶点取交集得到的93个,通过DAVID数据库进行GO和KEGG分析,从而确定ZHZTP所调控的信号通路及所调控的相关分子功能。GO功能分析中biological function(BP)、molecular function(MF)和cell components(CC)均取中的绘制柱形图,结果如Fig 4,表明ZHZTP对BP、MF和CC均有影响。KEGG通路富集得到共156条信号通路(P<0.05),从中选取前20的绘制气泡图。结果表明,ZHZTP的功能主要富集在PI3K-AKT、TNF和IL-6信号通路。

2.1.5蛋白质-蛋白质互作关系(PPI)分析及核心靶点筛选将RA疾病相关靶点与ZHZTP有效成分靶点取交集得到的93个靶点(Fig 1)。Network Analysis分析筛选满足degree、betweenness和close-ness大于平均值的靶点前20,见Tab 1。其中,位居前3的分别是AKT1、TNF和IL-6,它们在PPT网络(Fig 3)中占据核心地位,可能是ZHZTP治疗RA的核心靶点。因此,使用AutoDock vina软件,将关键活性成分熊果酸、大黄素与上述核心靶点AKT1、TNF和IL-6进行分子对接,确定其结合作用、结合位点及键长,结果用pymol软件展示,如Fig 5所示;它们之间的结合能对接结果如Tab 2所示。其中,单一化合物与3个核心靶点的比较中,我们发现大黄素与熊果酸与核心靶点结合能由低到高依次为AKT1

Tab 2 Binding energy by interaction of compounds and targets

最后,本研究也总结ZHZTP“有效成分-重要靶点-信号通路”网络调控作用关系(Fig 6),内圈粉红色代表ZHZTP抗RA重要有效成分;中间圈橘黄色代表上述重要有效成分作用于RA疾病过程中重要的靶点;外圈蓝色代表上述重要靶点所介导的信号通路。

2.2 细胞实验结果

2.2.1栀黄止痛散对HUVECs活力的影响采用MTT法考察不同浓度ZHZTP处理后细胞活力的影响,IC50=2 232 mg·L-1(Fig 7A)。与正常对照组比较,ZHZTP在给药浓度为0～62.5 mg·L-1时对细胞活性无明显抑制作用。确定50,25,12.5 mg·L-1浓度为后续研究剂量,ZHZTP在选定浓度下对细胞活性均抑制作用(Fig 7B)。

2.2.2栀黄止痛散对TNF-α诱导的HUVECs增殖的影响采用MTT法考察不同浓度ZHZTP对TNF-α诱导的HUVECs增殖的影响,细胞活力在一定程度上体现细胞的增殖活性。与空白组比较,模型组能明显促进HUVECs的增殖(P<0.01);与模型组比较,ZHZTP治疗组细胞增殖活性均明显降低(P<0.01)(Fig 7C)。

2.2.3栀黄止痛散对TNF-α诱导的HUVECs 迁移能力的影响划痕实验结果显示,与空白组比较,模型组愈合率明显增加(P<0.01);与模型组比较,ZHZTP治疗组愈合率明显减少(P<0.01)(Fig 8)。

Fig 2 Network profile of targets regulated by Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA pathogenesis

Fig 3 The PPI network map of Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA treatment

Fig 4 GO and KEGG enrichment for mechanism regulated by active compounds of Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA treatment

Fig 5 Molecule docking between active compounds and targets

2.2.4栀黄止痛散对PI3K/AKT/m-TOR信号通路蛋白表达的影响 Western blot 结果显示(Fig 9),与空白组比较,模型组 HUVECs中PI3K,AKT,m-TOR蛋白相对表达水平明显升高;与模型组比较,ZHZTP治疗组PI3K、AKT及m-TOR蛋白相对表达明显降低。

3 讨论

ZHZTP临床用于治疗RA,疗效显著,但其物质基础及作用机制尚不清楚。本研究运用网络药理学方法分析其抗RA有效成分及相关作用机制。结果表明,ZHZTP中通过调控RA疾病过程重要靶点的主要有效成分有20种,其中,熊果酸、大黄素位居前二,对RA疾病过程重要靶点的调控作用强于其它治疗RA的有效成分。提示这两个成分与RA重要靶点密切相关,可能是ZHZTP治疗RA的核心有效成分。另外,进一步分析这两个核心有效成分,发现它们均来自栀子(君药)和大黄(君药);且两个成分与ZHZTP治疗RA的核心靶点AKT1、TNF和IL-6的结合能表现一致,以上可阐明ZHZTP中栀子、大黄共为君药的合理性,及各药物君臣佐使配伍相对合理,可发挥协同抗RA作用。

本研究也发现ZHZTP治疗RA的核心靶点依次为AKT1、TNF和IL-6,对接结果也显示核心有效成分与它们之间均有结合作用,且与AKT1结合能最低。核心靶点中TNF-α、IL-6均在RA滑膜微环境中高度表达,并通过直接或间接作用于RA滑膜组织中的不同细胞类型产生促血管生成分子,促使内皮细胞异常增殖,促进微血管新生进一步形成RA病理血管翳[9-11]; AKT1属于PI3K-AKT通路蛋白,该通路介导细胞增殖、分化和凋亡等多种细胞功能[12];这3个靶点与RA密切相关。提示,ZHZTP可通过作用AKT1和TNF、IL-6调控RA疾病的细胞水平和分子水平,从而发挥治疗RA的作用。

Fig 6 Complicated network of “active compounds-targets-pathways” mediated by Zhi-Huang-Zhi-Tong powder in RA treatment

Fig 7 Effect of ZHZTP on cell viability of HUVECs or TNF-α-stimulated HUVECs

考虑到RA病理性血管翳的形成是由于血管内皮细胞迁移及侵袭能力增强,促进滑膜组织新生血管形成,为增生的滑膜组织供血供氧,进一步促进滑膜增生,加重RA病理发生发展。因此,我们分别考察ZHZTP对HUVECs活力及迁移能力的影响。

此外,TNF-α在RA病理过程中起着“中心犯罪的作用”,因此,我们采用TNF-α诱导HUVECs研究VEC功能的重要细胞系)细胞模型,评估ZHZTP对TNF-α诱导HUVECs活力、迁移作用及相关机制。研究发现ZHZTP可抑制由TNF-α诱导的HUVECs异常增殖,及迁移;进一步机制研究发现ZHZTP可能与下调PI3K/AKT/m-TOR信号通路有关。