超声波萃取苦荬菜叶中β-谷甾醇的工艺优化及其动态积累

闫雨婷,郝俊峰,荣 荣,贾玉山,王志军,格根图*

(1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院,农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室,草地资源教育部重点实验室,内蒙古 呼和浩特 010019; 2.兴安盟林业和草原局,内蒙古 乌兰浩特 137400)

苦荬菜(LactucaindicaL.),别名山莴苣、苦菜、鹅菜、凉麻等,是菊科莴苣属的一年生或多年生草本植物,野生种分布遍及全国[1-3]。苦荬菜对环境的适应性极强,具有耐寒耐旱、耐盐碱和耐瘠薄等优点,在我国分布较广[4],东三省及内蒙古地区均大面积种植[5]。苦荬菜营养价值丰富,是一种适口性极好的高产优质的青绿饲料。其叶量大,脆嫩多汁带苦味,鲜草可直接饲喂各种畜禽和草食性鱼类,也可打浆添加草粉、米糠等饲喂[6-7]。此外,苦荬菜还具有较高的药用价值,其富含黄酮类、脂类、萜类、甾醇类等活性物质,具有清热解毒、消炎止痛、抗氧化、抗衰老和抗肿瘤等生物活性[8-9]。

蒙早苦荬菜(LactucaindicaL.cv. Mengzao)含有丰富的活性物质,包括甾醇类物质,且多集中于开花初期的叶片中[4,10]。作为蒙早苦荬菜中主要的活性物质,天然甾醇存在于各种植物中,目前植物甾醇已应用于食品、化妆品、医药、工业等领域[11]。植物甾醇主要包括豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇、谷甾烷醇等。而β-谷甾醇是植物甾醇的主要成分,占总量60%～90%[12]。在医疗领域,植物甾醇作为一组植物来源的化合物,能够降低血液中有害胆固醇的水平和动脉粥样硬化的风险[13]。采用β-谷甾醇对小鼠进行干预治疗,可以达到抑制神经炎症、神经细胞凋亡和氧化应激的效果,改善小鼠的认知功能[14]。王凯等[15]研究发现β-谷甾醇对肝癌细胞的凋亡有促进作用,可抑制肝癌细胞的增殖。在养殖业领域,β-谷甾醇的促生长、抑菌、抗炎和免疫调节等生物学特性使它在无抗养殖中具有良好的应用前景[16]。日粮中添加β-谷甾醇能改善肉鸡饲料效率[17]。

目前,关于植物甾醇的提取方法有多种,常见的提取方法有溶剂结晶法、络合法、皂化法、蒸馏法(简单蒸馏法、分子蒸馏法)、吸附法(柱吸附法、高压流体吸附法)、超临界CO2萃取法、酶提取法等[18-19]。对于植物甾醇提取工艺的研究中,大部分采用热水浸提法、乙醇回流法等[20],这类工艺有提取时间较长、提取温度较高、提取率较低的缺点。而超声波法具有时间短、提取率高、不需加热(不破坏热敏有效成分)等优点[21],现如今关于植物甾醇提取的研究也多围绕此方法进行[22-24]。本研究以蒙早苦荬菜叶片为材料,通过超声波提取法,研究不同时间、温度、超声频率、料液比对蒙早苦荬菜叶中提取量的影响,并探究其动态积累规律。通过本研究,可为苦荬菜的精深加工提供方向,也为进一步开发和利用β-谷甾醇奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为蒙早苦荬菜,是内蒙古农业大学培育的饲草品种。2018年6月—2018年9月,选取不同生育期(幼嫩期、营养生长期、开花初期、开花中期、开花末期和结实期)的蒙早苦荬菜叶片,分别采集不同植株叶片,将采集的新鲜叶片冲洗并自然晾干表面水分,用植物粉碎机粉碎,过60目标准筛,备用。

1.2 试剂与仪器

试剂:无水乙醇、甲醇(均为色谱纯),甾醇标准品(β-谷甾醇),均购于上海源叶生物科技有限公司。

仪器设备:E2695-2489高效液相色谱紫外联用仪,沃特世科技(上海)有限公司;C18 4.6×250 mm,5 μm色谱柱,美国安捷伦科技有限公司;VOSHIN-1500C低温超声波萃取仪,无锡沃信仪器制造有限公司。

1.3 测定指标及方法

1.3.1超声波辅助提取法

①单因素试验设计:以70%乙醇为提取溶剂,以超声时间、温度、频率、料液比为四因素设计单因素试验,重复3次。

时间:固定温度30℃、频率20 KHz、料液比1∶10 g·mL-1,分别考察不同提取时间(min)对苦荬菜主要活性物质提取量的影响。

温度:固定时间20 min、频率20 KHz、料液比1∶10 g·mL-1,分别考察不同提取温度(℃)对苦荬菜主要活性物质提取量的影响。

频率:固定时间20 min、温度30℃、料液比1∶10 g·mL-1,分别考察不同提取频率(KHz)对苦荬菜主要活性物质提取量的影响。

料液比:固定时间20 min、温度30℃、频率20 KHz,分别考察不同料液比(g·mL-1)对苦荬菜主要活性物质提取量的影响。

②正交试验设计:在单因素试验基础上,采用超声波辅助提取法,以70%乙醇为提取溶剂,将时间、温度、频率、料液比为四因素,按L9(34)正交试验进行苦荬菜活性物质的提取,重复3次。

③验证试验:基于正交试验结果,称取1.00 g粉碎样品,在最适提取条件下,平行试验3次。

1.3.2色谱条件 流动相:100%甲醇等度洗脱。流量:1.0 mL·min-1。进样量:20 μL。检测波长:205 nm。柱温:30℃。甾醇高效液相色谱图见图1,其A为β-谷甾醇标准品溶液,B为样品溶液。

1.3.3对照品溶液制备 称取β-谷甾醇2.95 mg,精密称取至100 mL容量瓶中,用70%甲醇稀释溶解定容至25 mL,摇匀静置15 min,分别取2 mL,4 mL,6 mL,8 mL,10 mL,12 mL配制成23.13 μg·mL-1,46.26 μg·mL-1,69.39 μg·mL-1,92.52 μg·mL-1,115.65 μg·mL-1,138.78 μg·mL-1的标准溶液,在色谱条件下进行分析,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。

1.3.4方法检验

①线性关系:在相同色谱条件下,将不同质量浓度的对照品溶液分别进样10 μL,色谱峰面积为纵坐标,对照品质量浓度为横坐标,得回归方程Y=54.289x-260.36,R2=0.999 9,对照品在β-谷甾醇质量浓度23.13～138.78 μg·mL-1范围内有良好线性关系。

②精密度试验:将最低浓度的照品溶液进样10 μL,在拟定的色谱条件下连续进样6次,记录峰面积。相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)=0.13%(n=6),表明仪器精密度良好。

③稳定性试验:将供试品溶液在0 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h时进样10 μL,平行试验6次,记录峰面积,相对标准偏差(RSD)=0.28%(n=6),其供试品溶液在24 h内稳定。

④重复性试验:精密称取苦荬菜样品粉末1.0 g 6份,按供试品溶液制备,在拟订色谱条件下进样10 μL,记录峰面积,RSD=0.95%(n=6),表明重复性良好。

⑤加样回收试验:称取已知提取量的苦荬菜样品粉末0.25 g左右,6份,用70%乙醇稀释至10 mL,按供试品溶液处理。加入1 mL β-谷甾醇标准品溶液(2.84 mg·mL-1),相同色谱条件下测定。结果平均回收率为95.66%,RSD为0.06%,表明该测定方法合理。

1.3.5数据统计分析 利用SAS 9.4软件进行数据统计分析(ANOVA)、使用Excel进行图表制作、使用SPSS 23软件建立PROBIT回归模型。每个试验均进行3次重复。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1提取时间对甾醇提取率的影响 由图2可知,甾醇在20～80 min范围内呈先上升再下降的趋势,在提取时间20 min时最低,并由此开始升高,在提取时间40 min时达到最高,在60～80 min时持续下降。

图2 提取时间对β-谷甾醇物质提取量的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction of β-sitosterol

2.1.2提取温度对甾醇提取率的影响 由图3可知,甾醇提取率在40℃～70℃范围内呈先上升再下降的趋势,在40℃时最低,在40℃～60℃时持续上升,在60℃时最高,在60℃～70℃时下降,并在70℃条件下达到相对较低值。

图3 提取温度对β-谷甾醇物质提取量的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction of β-sitosterol

2.1.3料液比对甾醇提取率的影响 由图4可知,甾醇提取率在1∶10～1∶40 g·mL-1范围内呈先上升再下降的趋势,在1∶10～1∶20 g·mL-1时上升,在1∶20 g·mL-1时呈最高值,在1∶20～1∶40 g·mL-1时下降,1∶20～1∶30 g·mL-1时下降幅度较大,1∶30～1∶40 g·mL-1时下降幅度较小,在1∶10 g·mL-1时最低。

图4 料液比对β-谷甾醇物质提取量的影响Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction of β-sitosterol

2.1.4提取频率对甾醇提取率的影响 由图5可知,甾醇提取率在40～100 KHz范围内呈上升-下降-上升趋势,在40～60 KHz时上升,在60 KHz时最高,在60～80 KHz时下降,并在80 KHz时最低,在80～100 KHz时继续上升,100 KHz时达到相对较高值。

图5 提取频率对β-谷甾醇物质提取量的影响Fig.5 Effect of extraction ultrasonic frequency on extraction of β-sitosterol

2.2 正交试验结果分析

根据单因素试验,β-谷甾醇为研究对象,提取时间、提取温度、超声频率、料液比为因素,每一个因素设置三个水平,设计正交试验。正交试验结果如表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

由表2可知,β-谷甾醇提取量在提取条件A1B3C3D3时最高,即提取时间20 min、温度60℃、频率80 KHz、料液比为1∶30 g·mL-1,提取量为12.08 mg·g-1,与其他组相比差异显著(P<0.05)。由R值可知,各因素对苦荬菜甾醇提取量的影响大小顺序为:D>A>C>B,即料液比>时间>频率>温度。根据K值,最佳提取条件为A1B1C3D3,与甾醇提取量为最高的试验组条件不一致,需进一步验证试验。

表2 超声波辅助提取法正交试验设计与结果分析Table 2 Ultrasonic -assisted extraction orthogonal test design and result analysis

β-谷甾醇对照组提取量为2.64 mg·g-1,RSD为1.16%。在提取条件A3B3C3D1下,提取量达到12.08 mg·g-1,RSD为0.05%(表3)。在提取条件A1B1C3D3下,甾醇提取量为12.31 mg·g-1,RSD为0.84%(表3),显著高于其他两组(P<0.05)。

表3 验证试验结果Table 3 Verification test results

由表4可知,根据F值,甾醇各因素影响均极显著差异(P<0.01),甾醇正交试验平方和误差为0.07。

表4 超声波辅助提取法正交试验方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal test by ultrasonic assisted extraction

2.3 不同生育时期干燥样品中的活性物质提取量差异

将苦荬菜新鲜叶片干燥处理后,根据正交试验结果分别提取苦荬菜甾醇物质,分析苦荬菜甾醇物质提取量随生育时期的变化。

由图6可知,不同生育期的叶中甾醇提取量差异较大,呈下降-上升-下降的趋势。在开花初期,甾醇提取量最高,达13.22 mg·g-1。在结实期时最低,仅有6.35 mg·g-1。因此,对叶片甾醇物质的提取最好选择在开花初期,以便获得最大量的活性物质。

图6 蒙早苦荬菜β-谷甾醇提取量随生育时期变化分析Fig.6 Analysis of the variation of β-sitosterol extraction with fertility period in Lactuca indica L.cv. Mengzao注:图中不同大写字母表示差异显著(P<0.05)Note:Different capital letters in the figure indicate significant differences(P<0.05)

3 讨论

超声辅助提取是一种利用超声波辐射产生的多级效应加速目标成分进入溶剂,提高提取效率的方法[25]。超声辅助不仅能降低萃取温度,加快能量转移,选择性萃取,更利于提取热敏化合物,还可使用多种溶剂[26]。荣荣[4]通过研究得到超声波辅助提取法与其他两种提取法相比更适用于苦荬菜甾醇类物质的提取。本研究的最佳工艺条件为时间20 min、温度40℃、频率80 KHz、料液比1∶30 g·mL-1,提取量为13.22 mg·g-1。提取量随提取时间的增加呈先上升后下降的趋势,是由于随着超声时间地增加细胞膜破碎数量越多,破碎程度越大,植物甾醇溶出越多,但超声时间超过40 min后,细胞破碎程度增大后杂质也相应增多,不利于植物甾醇提取,提取量有所降低[27]。在本研究中,提取量随提取温度的增加呈先上升后下降的趋势,原因可能是,当温度高于60℃时,溶剂汽化程度变大,减小了溶剂与原料的接触面积,同时可能造成有效成分的分解,从而降低了植物甾醇的提取量[28]。提取量随料液比的增加呈上升-下降-平缓的趋势,随着溶剂体积增加,原料与提取溶剂接触面积增大,溶出的植物甾醇随之增多,其提取量显著增加,当料液比达到1∶20 g·mL-1时,提取量最大,随着提取溶剂体积的继续增加,其他物质会随着体积增大而相应增加,抑制植物甾醇溶出,植物甾醇含量有所下降,最终趋于平缓。提取量随超声频率的增加呈先上升后下降的趋势,由于超声波功率越大,空化作用越强烈,但超声功率增大到一定程度时(频率80 KHz)容易产生大量无用的空化泡,增加散射衰减,形成声屏障,反而会减弱提取效果[29]。夏秋敏等[30]对苹果籽进行植物甾醇的提取,得出的最佳提取工艺与本研究差异较大。李会珍等[27]对紫苏中甾醇物质进行提取得出的最佳工艺也与本研究存在差异。因此,不同植物材料需要不同提取工艺条件才可最大限度地提取出活性物质。

本文对蒙早苦荬菜干燥叶片进行了不同生育期活性物质提取量差异的研究。李赛飞等[31]从段木灵芝子中提取活性物质,研究表明在段木灵芝生产过程中,子实体弹射孢子早期之前,采收越早,多糖和三萜含量越高。随着生育期的推移,植物不断的生长同时积累营养物质,但当达到营养峰值时,茎叶比例增加,逐渐老化,植株中结构性碳水化合物含量增加,影响化学营养成分含量的变化[32]。在一般条件下,植物的光合作用和酶活性对植物的生长发育和有效成分的积累有影响[33-34]。在本研究中,甾醇类物质的提取量在开花初期达到最高水平,随后呈现下降趋势。其原因可能为随着夏季气温的升高,叶片中的养分迅速积累,但随之被花吸收,叶片中β-谷甾醇含量随之下降[35]。董金平等人[36]指出,中华苦荬菜中的活性成分在5-7月生长旺盛期提取量达到最高,同样王璐璐等人[37]从中华苦荬菜中提取有效成分,发现活性提取物提取量在盛花期达到峰值,之后逐渐下降。本研究选择开花初期获得了预期成果,这与上述研究结论一致。研究发现在对苦菜各部位进行总黄酮的提取时,各部位中叶片含量最高[38]。马春梅等人[39]从菊科植物毛菊苣中提取甾醇类物质,发现它们主要集中于花与叶片中。因此,本文选择叶片部位、开花初期进行试验是最优选择。在对植物活性物质类物质进行研究提取时,应优先考虑叶片部位。

4 结果

本研究以蒙早苦荬菜叶片为原料,结合超声波辅助提取法,利用单因素试验及正交试验确定了甾醇类物质最佳提取工艺为提取时间20 min,温度60℃,频率80 KHz,料液比1∶30 g·mL-1。在此工艺条件下,甾醇类物质的含量达到最高,为12.08 mg·g-1。各因素对苦荬菜中β-谷甾醇提取量的影响大小顺序为:料液比>时间>频率>温度。β-谷甾醇提取量最高的生育时期为开花初期,此时高达13.22 mg·g-1。