基于高效液相色谱指纹图谱结合化学计量法分析广西鹅掌柴质量*

杨馨,徐念智,符文凤,张文涛,殷汉智,李兵

(广西中医药大学药学院,南宁 530200)

广西鹅掌柴(SchefflerakwangsiensisMerr.ex Li)为五加科鹅掌柴属植物,性味微苦、性温,别名汉桃叶、七叶莲、七加皮、白花鹅掌柴等,主产于广西。民间多以根、皮、茎叶入药,有祛风止痛、舒筋活络的功能[1]。《中华本草》描述该属植物多可“祛风除湿、活血消肿。用于治疗风湿痹痛,跌打肿痛,骨折,头痛、腰痛、脘腹疼痛等多种疼痛症”[2]。目前国内外对广西鹅掌柴的药效物质基础、质量控制等研究较少,研究表明,其主要的化学成分主要是三萜皂苷类[3-4],另外该属植物中还含有甾醇、长链烯烃、有机酸、挥发油[5-6]等成分。中药指纹图谱作为中药应用较为广泛的质量评价模式之一[7],采用多维多息指纹图谱技术,能全面反映中药所包含的化学信息,但主要集中于整体相似度评价,差异性不够突出,化学模式识别技术则强调数据之间的差异性,恰好可以弥补中药指纹图谱的不足,两者结合可在整体评价的基础上体现出差异性成分的信息[8]。笔者在本研究建立广西鹅掌柴高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,从整体角度得到该药材的较多化学成分信息。特征图谱的建立为广西鹅掌柴的应用提供可靠的质量标准控制方法。

1 仪器与材料

1.1仪器 岛津高效液相色谱仪(LC-2030 Plus);CPA225D 型电子天平(德国赛多利斯公司,感量:0.01 mg);KQ5200B 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2材料 甲醇、乙腈为色谱级;红景天苷对照品(批号:110818-200404)、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品(批号:111894-201102)、咖啡酸对照品(批号:110885-201703)均购于中国食品药品检定研究院;柚皮素对照品(批号:20130306,含量≥98.0%)购于广西南宁百会药业集团有限公司;水为超纯水,其余试剂均为分析纯。10批广西鹅掌柴药材均采自广西各地区,见表1,经广西中医药大学韦松基教授鉴定为五加科鹅掌柴属植物广西鹅掌柴(SchefflerakwangsiensisMerr.ex Li)的根、茎部分。

表1 10个产地广西鹅掌柴药材来源

表2 10个不同产地广西鹅掌柴共有峰相对保留时间

表3 10个不同产地广西鹅掌柴共有峰相对峰面积

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为 COSMOSIL 5C18-PAQ 柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇(C)-0.1% 磷酸溶液(D),梯度洗脱(0～10 min,5%C;10～15 min,5%→15%C;15～25 min,15%→30% C;25～45 min,30%→40% C;45～70 min,40%→60%C;70～90 min,60%→75% C;90～110min,75%→100%C;110～130 min,100%C);流速为 0.7 mL·min-1,柱温为30 ℃,检测波长为 287 nm,进样量为 20 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取红景天苷、4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、柚皮素对照品适量,置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,经孔径0.22 μm微孔滤膜滤过,即得混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 取10批广西鹅掌柴样品粉末各 2 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,分别加入甲醇15 mL,称定质量,超声(200 W,40 kHz) 提取40 min,放冷,补重,滤过,滤液经孔径0.22 μm微孔滤膜滤过,即得。

2.2.3空白溶液 取甲醇溶液作为空白溶液,即得。

2.3方法学考察

2.3.1专属性实验 为排除空白试剂干扰,取“2.2.3节”空白溶液,按 “2.1节”色谱条件进样,结果表明甲醇溶剂对色谱峰的出峰情况没有干扰。

2.3.2精密度实验 取广西鹅掌柴(S3) 粉末2 g,精密称定,按“2.2.2节”方法制备供试品溶液。按 “2.1节”下色谱条件连续进样6次,以18号柚皮素色谱峰为参照峰(S),计算各共有峰相对保留时间和峰面积的RSD值,结果均小于3.0%,表明仪器精密度良好。

2.3.3重复性实验 取同一批广西鹅掌柴粉末(S3) 6份,每份约2 g,精密称定,按“2.2.2节”方法制备供试品溶液,按“2.1节”色谱条件进样测定,以18号柚皮素色谱峰为参照峰(S),计算各共有峰相对保留时间和峰面积的RSD值,结果显示均小于3.0%,表明该方法重复性良好。

2.3.4稳定性实验 取同一批广西鹅掌柴粉末 (S3)2 g,精密称定,按“2.2.2节”方法制备供试品溶液,按“2.1节”色谱条件,分别在0、4、8、12、16、24 h 进样,以18号柚皮素色谱峰为参照峰(S),计算各共有峰相对保留时间和峰面积的RSD值,结果显示均小于3.0%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4HPLC指纹图谱的建立及共有峰的指认 取10个不同产地广西鹅掌柴,按“2.2.2节”方法制备样品溶液,进样测定,将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012 版)”,以S3号样品图谱为参照,中位数法生成对照图谱,设定时间窗宽度为0.1,进行图谱匹配,得到 HPLC 指纹图谱叠加图及生成的对照图谱(图1、图2),共标定有22个共有峰。通过与对照品色谱图(图3) 比对,确定1号为红景天苷、13号为4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸、14号为咖啡酸、18 号为柚皮素。以18号柚皮素色谱峰为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积,结果见表1～3。各共有峰相对保留时间的RSD数值为0.006%～0.15%,表明不同产地药材共有峰出峰时间较稳定,而相对峰面积的RSD数值为1.36%～33.42%,说明不同产地药材指纹图谱中的色谱峰之间的相对峰面积不同,各化学成分含量有一定差异。10个不同产地广西鹅掌柴样品指纹图谱相似度评价结果见表4,各产地样品的相似度在0.922～0.999,表明各产地药材的质量相对稳定,其化学成分基本一致。

图1 10个不同产地广西鹅掌柴色谱峰图

图2 广西鹅掌柴对照指纹共有模式图

1.红景天苷;13.4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸;14.咖啡酸;18.柚皮素。

表4 10个不同产地广西鹅掌柴指纹相似度结果

2.5聚类分析(cluster analysis,CA) 采用SPSS 24.0版软件,以10个广西鹅掌柴样品的22个共有峰峰面积为变量,采用组间联接,平方Euclidean 距离作为度量标准,进行聚类分析,结果见图4。当欧氏距离约为12时,样品分成4类,S4、S5、S6、S7 号样品为一类;S9号样品为一类;S1、S2号样品为一类;S3、S8、S10为一类。聚类分析发现,10个不同产地广西鹅掌柴存在一定的差异,该差异可能与采集地点、采集时间、气候等外界因素有一定的关系,其具体差异性原因有待进一步分析。

图4 10个不同产地广西鹅掌柴样品聚类分析图

2.6主成分分析(principal component analysis,PCA) 以广西鹅掌柴22个共有峰面积为变量,采用SPSS 24.0版软件进行主成分分析,计算其特征值和方差贡献率,以特征值>1为标准,得到4个主成分,其累计方差贡献率为95.39%,结果见表5,累计方差贡献率较全面地体现出广西鹅掌柴化学成分的基本特征。结合样品PCA碎石图(图5)分析,图中的曲线自第5个主成分开始存在1个明显的拐点,而剩余其他成分的斜率相对较平缓,表明提取前4个主成分进行分析较为适宜。

图5 广西鹅掌柴主成分分析碎石图

表5 广西鹅掌柴主成分分析特征值和方差贡献率

用SPSS 24.0版软件进行因子分析时,得到的是因子载荷矩阵,见表6,主成分的贡献大小取决于载荷的绝对值大小。由表6可知,峰7、8、9、11、12、14、15、18、19、20、21在主成分1 有较高的载荷,峰2、6在主成分2有较高的载荷,说明以上各色谱峰对该广西鹅掌柴的质量贡献较大。提示可将其作为广西鹅掌柴的质量控制指标性成分。计算主成分得分时,需要用未旋转的因子载荷矩阵的系数除以对应成分特征根的平方根作为指标的系数权重,即特征向量。特征向量U由因子载荷矩阵A以及特征值λ计算而来,即Ui=(Ai/λi)1/2,求得特征向量[9],结果见表7。

表6 广西鹅掌柴主成分分析因子载荷矩阵

表7 广西鹅掌柴主成分分析特征向量

以X1、X2、X3、X4 代表4个主成分作为 10 个广西鹅掌柴样品成分所表达的信息,以标准化的共有峰峰面积(A1～A22)为变量,建立起品质评价模型,计算其综合得分。X1=0.218Z1+0.163Z2+0.208Z3+0.180Z4+0.017Z5+0.122Z6+0.273Z7+0.228Z8+0.238Z9-0.056Z10+0.253Z11+0.254Z12+0.198Z13+0.257Z14+0.252Z15+0.193Z16-0.075Z17+0.251Z18+0.253Z19+0.265Z20+0.257Z21+0.213Z22;X2=-0.207Z1+0.351Z2+0.197Z3+0.118Z4+0.386Z5+0.395Z6-0.022Z7-0.156Z8+0.098Z9-0.276Z10+0.098Z11-0.122Z12-0.264Z13+0.108Z14+0.102Z15-0.322Z16-0.133Z17+0.118Z18+0.102Z19-0.108Z20-0.164Z21-0.254Z22;X3=-0.033Z1+0.230Z2+0.295Z3+0.005Z4+0.377Z5+0.252Z6-0.027Z7+0.002Z8-0.099Z9+0.474Z10-0.117Z11+0.146Z12+0.224Z13-0.128Z14-0.079Z15+0.111Z16+0.512Z17-0.132Z18-0.131Z19+0.004Z20+0.033Z21+0.008Z22;X4=-0.124Z1+0.054Z2-0.034Z3-0.53Z4-0.063Z5-0.079Z6-0.063Z7+0.317Z8-0.369Z9+0.043Z10+0.242Z11-0.079Z12+0.201Z13+0.160Z14+0.260Z15-0.116Z16+0.181Z17+0.225Z18+0.230Z19-0.108Z20-0.035Z21-0.286Z22;综合得分X=(0.598 47X1+0.176 51X2+0.122 54X3+0.056 37X4)/0.953 88,广西鹅掌柴成分得分及排名见表8,其中S1、S3、S8得分最高。为进一步分析10个广西鹅掌柴样品的组间差距,将广西鹅掌柴22个共有峰峰面积导入SIMCA 13.0版软件绘制 PCA 得分图(图6),10个广西鹅掌柴样品被分为四类,其中S4、S5、S6、S7 号样品为一类;S9号样品为一类;S1、S2号样品为一类;S3、S8、S10为一类。该结果与聚类分析结果一致。

图6 10个不同产地广西鹅掌柴PCA-X得分图

表8 广西鹅掌柴成分得分及排名

2.7正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA) 在PCA-X的基础上,以广西鹅掌柴22个共有峰面积为变量,采用SIMCA 13.0版软件进行正交偏最小二乘法-判别分析。结果显示,模型解释率参数(R2X、R2Y)分别为0.999、0.997,模型预测能力参数(Q2)为0.891,均>0.5,表明该模型较稳定可靠。OPLS-DA得分图见图7,10个广西鹅掌柴样品被分为四类,其中S4、S5、S6、S7 号样品为一类;S9号样品为一类;S1、S2号样品为一类;S3、S8、S10为一类。该结果与聚类分析结果一致。根据变量重要性投影值(variable importance in the projection,VIP)图(图8)可知,VIP>1 的色谱峰有4号峰(VIP=2.61)、11号峰(VIP=1.74)、5号峰(VIP=1.22)、1号峰(VIP=1.14)、2号峰(VIP=1.12)、6号峰(VIP=1.09),表明这6个共有成分可能是影响该药材质量差异的主要标志性成分,其产地的差异性可能是多个成分共同影响的结果。

图7 10个不同产地广西鹅掌柴OPLS-DA得分图

图8 10个不同产地广西鹅掌柴20个共有峰的VIP图

3 讨论

3.1提取工艺的优化 分别考察不同提取方式、甲醇浓度、提取时间和提取溶剂等因素,发现甲醇15 mL,超声提取40 min,色谱峰的分离度和峰面积最佳,可作为该供试品溶液的制备方法。

3.2色谱条件的优化 对不同的流动相(甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水),流速(0.6、0.7、1.0 mL·min-1),柱温(25、30、35 ℃),进样量(10、15、20 μL),色谱柱[COSMOSIL 5C18-PAQ 柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm)、welch XB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、UItimate LP-C18色谱柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm)],根据色谱峰分离情况等确定上述最佳色谱条件。在比较不同色谱条件时,进行耐用性考察,各特征峰相对保留时间、相对峰面积基本一致,表明流速、进样量、柱温、色谱柱等在不同条件变化时,对检测结果影响较小。

3.3指纹图谱结合化学计量法结果分析 10个不同产地广西鹅掌柴指纹图谱相似度为0.922～0.999,说明不同产地药材质量稳定性较高,该评价手段主要集中于整体相似度评价,差异性不够突出。故本文结合化学计量法手段,弥补了指纹图谱的不足,重点分析10个不同产地广西鹅掌柴色谱峰之间的差异性,聚类分析将10个样品分成4类,主成分分析得到4个主成分,累计方差贡献率达 95.39%,OPLS-DA分析也将10个不同产地广西鹅掌柴分成4类,与聚类分析结果一致,同时分析不同产地广西鹅掌柴主要差异标志性的物质,指认了部分色谱峰。从本文研究结果可见,两者评价手段的结合,既能全面地体现出广西鹅掌柴化学成分的整体信息,又能通过化学计量法手段突出不同产地之间个体差异性,为广西鹅掌柴的整体质量评价提供了可靠的分析方法。