吴茱萸碱调节cAMP/PKA信号通路在糖尿病大鼠视网膜损伤中的作用△

2024-01-30刘珊珊胡菲菲王洪华

眼科新进展 2024年2期

刘磊刘珊珊胡菲菲王洪华王莹

内分泌失调可引起糖尿病,而糖尿病视网膜病变是糖尿病最常见的微血管并发症,据统计,50%的病程超过7年的糖尿病患者患有糖尿病视网膜病变[1-3]。此外,神经节细胞凋亡、炎症和氧化应激是糖尿病视网膜病变的三大主要病理特征[4-6]。目前,眼内注射抗血管内皮生长因子、类固醇等治疗视网膜血管功能障碍的药物发展迅速,但一些不良反应仍时有发生[7]。因此,开发新的改善视网膜损伤的药物对于糖尿病视网膜病变的治疗具有重要意义。吴茱萸碱(EVO)是一种从吴茱萸(芸香科)未成熟的干燥果实中提取的生物碱,其可以降低糖尿病大鼠的血糖,改善氧化应激和炎症反应[8]。但EVO能否改善糖尿病大鼠视网膜损伤尚未完全明确。相关研究显示,激活环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)信号通路改善了高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞炎症反应和凋亡损伤[9];且EVO可调控异丙肾上腺素损伤的β1-AR/CHO-S细胞中cAMP、PKA表达[10]。然而EVO能否调控cAMP/PKA信号通路改善糖尿病大鼠视网膜损伤尚未完全明确。因此,本研究主要探究EVO对糖尿病大鼠视网膜病变的改善作用以及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

96只(192眼)6周龄的雄性SD大鼠,体重为200～210 g,购自导科医药技术(广东)有限公司[生产许可证号:SCXK(粤)2022-0060]。所有动物实验均经本院动物保护与使用委员会批准进行,符合实验动物使用条例,获山东第一医科大学第二附属医院伦理委员会审批(批号:2022-111)。

1.1.2 主要试剂

EVO(规格:20 mg)购自滁州仕诺达生物科技有限公司;链脲佐菌素购自上海宝曼生物科技有限公司;羟苯磺酸钙(CD)购自上海源叶生物科技有限公司;cAMP抑制剂SQ22536购自上海西格生物科技有限公司;大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒均购自深圳海思安生物技术有限公司;大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素 (IL)-6、cAMP ELISA试剂盒均购自上海富雨生物科技有限公司;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自北京伊塔生物科技有限公司;兔源一抗Bcl-2相关X蛋白(Bax)、P53、磷酸化的PKA(p-PKA)、PKA、GAPDH及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病视网膜病变大鼠模型的构建

将大鼠按照55 mg·kg-1的剂量腹腔注射链脲佐菌素,72 h后若尾静脉血糖>16.7 mmol·L-1则认为糖尿病大鼠模型构建成功[11];继续喂养8周后,处死大鼠,收集大鼠视网膜组织,根据视网膜病理变化判断糖尿病视网膜病变大鼠模型是否构建成功[12]。

1.2.2 实验分组

按照随机数字表法将96只SD大鼠随机分为对照组(NC组)12只(24眼)、糖尿病视网膜病变组84只(168眼)。NC组除以腹腔注射生理盐水代替链脲佐菌素外,其他操作同造模过程,糖尿病视网膜病变组大鼠按照1.2.1所述方法构建糖尿病视网膜病变大鼠模型后,若大鼠的视网膜病理变化符合糖尿病视网膜病变的特点则为模型构建成功,经鉴定,糖尿病视网膜病变大鼠模型构建成功率为100%。将84只糖尿病视网膜病变组大鼠按照随机数字表法随机分为模型组(Model组)、EVO低剂量组(EVO-L组)、EVO中剂量组(EVO-M组)、EVO高剂量组(EVO-H组)、CD组、SQ22536组、EVO-H+SQ22536组,每组12只。EVO-L组、EVO-M组、EVO-H组大鼠分别灌胃10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、40 mg·kg-1EVO[13],且均同时行腹腔注射等体积的生理盐水;CD组大鼠灌胃135 mg·kg-1CD[12],且还同时行腹腔注射等体积的生理盐水;SQ22536组大鼠腹腔注射 2.13 mg·kg-1SQ22536[14],且还同时灌胃等体积的生理盐水;EVO-H+SQ22536组大鼠灌胃40 mg·kg-1EVO,且还同时行腹腔注射2.13 mg·kg-1SQ22536;NC组、Model组大鼠灌胃等体积的生理盐水,且还同时行腹腔注射等体积的生理盐水。每天给药一次,持续4周。

1.2.3 标本收集

末次处理24 h后,收集每组全部大鼠(12只)的尾静脉血用于血糖的检测;尾静脉血收集后,处死大鼠,收集大鼠的视网膜组织,分为两部分,每部分包含6只大鼠的视网膜组织(双眼),一部分(6只12眼)固定于40 g·L-1多聚甲醛溶液中用于HE和TUNEL染色,另一部分(6只12眼)储存在-80 ℃中用于ELISA、Western blot及氧化应激指标的检测。

1.2.4 HE染色检测各组大鼠视网膜组织病理变化

取出固定在40 g·L-1多聚甲醛溶液中的每组6只大鼠双眼的视网膜组织,将固定的组织包埋在石蜡中,然后切片。HE染色后,显微镜下观察切片,分析各组大鼠视网膜组织病理损伤情况。

1.2.5 TUNEL染色检测各组大鼠视网膜组织中神经节细胞凋亡

取1.2.4中的视网膜组织切片,用二甲苯脱蜡,并用梯度乙醇水化,用磷酸盐缓冲溶液洗3次后,将组织切片置于蛋白酶K溶液中,并在室温下孵育 20 min。切片用无菌水洗涤2次,加入末端脱氧核苷酸转移酶标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸反应液,4 ℃孵育过夜。加入约50 μL封闭溶液并在37 ℃的潮湿箱中孵育30 min。磷酸盐缓冲溶液洗3次后加入DAPI,甘油缓冲液封片。使用荧光显微镜观察大鼠视网膜组织中视网膜神经节细胞凋亡情况。

1.2.6 ELISA检测各组大鼠视网膜组织中SOD、MDA、TNF-α、IL-6、cAMP水平

严格按照试剂盒说明书步骤检测每组另外6只大鼠双眼视网膜组织中SOD、MDA、TNF-α、IL-6、cAMP水平。SOD、MDA、TNF-α、IL-6、cAMP水平通过双抗体夹心法测定。

1.2.7 Western blot检测各组大鼠视网膜组织中Bax、P53、p-PKA蛋白表达

取1.2.6中的视网膜组织,使用RIPA裂解缓冲液提取每组另外6只大鼠双眼的视网膜组织匀浆总蛋白质。将蛋白质进行定量、电泳分离、转膜、封闭后,加入一抗Bax(1：2 000)、P53(1：2 000)、p-PKA(1：2 000)、PKA(1：2 000)、GAPDH(1：2 000)在4 ℃孵育过夜,加入HRP标记山羊抗兔二抗(1：1 000)孵育1 h,ECL试剂显影后,使用ImageJ软件对目的蛋白条带进行定量分析,以GAPDH为内参对照标准化Bax、P53蛋白表达,以PKA为内参对照标准化p-PKA蛋白表达。

1.3 统计学分析

使用SPSS 24.0统计学软件对数据进行分析,各组大鼠血糖、视网膜神经节细胞凋亡率、SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平及Bax、P53、cAMP、p-PKA蛋白表达水平均以均数±标准差表示。单因素方差分析用于分析多组数据间的差异,方差齐时,进一步两两比较采用SNK-q检验,检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 EVO对各组大鼠血糖的影响

各组大鼠血糖比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与NC组比较,Model组大鼠血糖升高,差异有统计学意义(P<0.05);与Model组比较,EVO-L组、EVO-M组、EVO-H组、CD组大鼠血糖均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与Model组比较,SQ22536组大鼠血糖升高,差异有统计学意义(P<0.05);与EVO-H组比较,EVO-H+SQ22536组大鼠血糖升高,差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠血糖及视网膜神经节细胞凋亡率比较

2.2 EVO对各组大鼠视网膜组织病理的影响

NC组大鼠视网膜细胞形态正常;与NC组比较,Model组大鼠视网膜细胞紊乱,视网膜厚度变薄,毛细血管内膜增生,基底膜增厚,神经节细胞减少,神经纤维层空泡变性。与Model组比较,EVO-L组、EVO-M组、EVO-H组、CD组大鼠视网膜组织病理损伤减轻;与Model组比较,SQ22536组大鼠视网膜组织病理损伤严重;与EVO-H组比较,EVO-H+SQ22536组大鼠视网膜组织病理损伤加剧(图1)。

图1 HE染色检测各组大鼠视网膜组织病理变化

2.3 EVO对各组大鼠视网膜组织中神经节细胞凋亡的影响

各组大鼠视网膜神经节细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与NC组比较,Model组大鼠视网膜神经节细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05);与Model组比较,EVO-L组、EVO-M组、EVO-H组、CD组大鼠视网膜神经节细胞凋亡率均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与Model组比较,SQ22536组大鼠视网膜神经节细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05);与EVO-H组比较,EVO-H+SQ22536组大鼠视网膜神经节细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05)(图2、表1)。

图2 TUNEL染色检测各组大鼠视网膜组织中神经节细胞凋亡情况

2.4 EVO对各组大鼠视网膜组织中SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平的影响

各组大鼠视网膜组织中SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与NC组比较,Model组大鼠视网膜组织中SOD水平降低,MDA、TNF-α、IL-6水平均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与Model组比较,EVO-L组、EVO-M组、EVO-H组、CD组大鼠视网膜组织中SOD水平均升高,MDA、TNF-α、IL-6水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与Model组比较,SQ22536组大鼠视网膜组织中SOD水平降低,MDA、TNF-α、IL-6水平均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与EVO-H组比较,EVO-H+SQ22536组大鼠视网膜组织中SOD水平降低,MDA、TNF-α、IL-6 水平均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表2)。

表2 各组大鼠视网膜组织中SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平比较

2.5 EVO对各组大鼠视网膜组织中Bax、P53蛋白及cAMP/PKA信号通路相关蛋白表达的影响

各组大鼠视网膜组织中Bax、P53、cAMP水平、p-PKA蛋白表达比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与NC组比较,Model组大鼠视网膜组织中Bax、P53蛋白表达升高,cAMP水平、p-PKA蛋白表达降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与Model组比较,EVO-L组、EVO-M组、EVO-H组、CD组大鼠视网膜组织中Bax、P53蛋白表达降低,cAMP水平、p-PKA蛋白表达升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与Model组比较,SQ22536组大鼠视网膜组织中Bax、P53蛋白表达升高,cAMP水平、p-PKA蛋白表达降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与EVO-H组比较,EVO-H+SQ22536组大鼠视网膜组织中Bax、P53蛋白表达升高,cAMP水平、p-PKA/PKA蛋白表达降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图3、表3)。

A:NC组;B:Model组;C:EVO-L组;D:EVO-M组;E:EVO-H组;F:CD组;G:SQ22536组;H:EVO-H+SQ22536组。图3 Western blot检测各组大鼠视网膜组织中Bax、P53、p-PKA、PKA蛋白表达

表3 各组大鼠视网膜组织中Bax、P53、cAMP水平、p-PKA/PKA蛋白表达比较

3 讨论

糖尿病视网膜病变作为糖尿病最严重的微血管病变并发症之一,严重威胁着患者的视力,并可能导致失明[15]。据报道,糖尿病病程延长可导致视网膜神经节细胞大量凋亡甚至死亡,神经节细胞数量减少。神经节细胞轴突形成视神经,神经节细胞损伤会影响患者的视力[16];炎症会引发一系列细胞异常,最终导致视网膜组织损伤,TNF-α、IL-6作为促炎介质,广泛参与了糖尿病视网膜病变的发病机制[17];SOD、MDA作为常见的评估氧化应激的指标,已有研究显示,在糖尿病大鼠视网膜组织中SOD水平降低,MDA水平升高[18]。本研究以腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病视网膜病变模型,结果显示,与NC组比较,Model组大鼠血糖升高,视网膜细胞紊乱,视网膜厚度变薄,毛细血管内膜增生,基底膜增厚,视网膜神经节细胞减少,神经纤维层空泡变性,表明糖尿病视网膜病变大鼠模型构建成功。此外,本研究结果表明,与NC组比较,Model组大鼠视网膜神经节细胞凋亡率、MDA、TNF-α、IL-6水平、凋亡相关蛋白(Bax、P53蛋白)表达均升高,SOD水平降低,表明视网膜神经节细胞凋亡、炎症反应及氧化应激参与了糖尿病视网膜病变大鼠视网膜损伤过程。提示抑制视网膜神经节细胞凋亡、炎症反应及氧化应激可能是改善糖尿病视网膜病变的有效策略之一。

EVO是一种从吴茱萸中提取的生物碱,具有多种药理活性,包括降血脂、降血糖、抗炎、抗感染和抗肿瘤等作用[19]。据报道,EVO对高葡萄糖引起血管内皮细胞炎性损伤具有改善作用[20];EVO可减轻胃溃疡模型大鼠胃黏膜组织损伤和炎症浸润,降低血清TNF-α、IL-6水平,减少胃黏膜上皮细胞凋亡数量,增加胃黏膜组织SOD水平,降低MDA水平[21]。以上研究表明,EVO具有抑制细胞凋亡、炎症反应及氧化应激的作用。本研究结果与其一致,本研究结果显示,EVO可抑制糖尿病视网膜病变大鼠视网膜神经节细胞凋亡、炎症反应及氧化应激,提示EVO可能是治疗糖尿病视网膜病变的潜在有效药物。

cAMP/PKA信号通路是经典的细胞内信号转导通路之一,cAMP通过将PKA磷酸化为p-PKA,从而引起细胞效应[22]。已有研究表明,糖尿病视网膜病变的发生和发展可能由高血糖状态下视网膜组织中cAMP含量降低所致[23];PKA可抑制高糖条件下培养的人视网膜内皮细胞炎症反应[24]。本研究结果与其一致,本研究结果表明,与Model组比较,SQ22536组大鼠视网膜组织中cAMP水平、p-PKA/PKA蛋白表达降低,糖尿病视网膜病变大鼠视网膜神经节细胞凋亡、炎症反应及氧化应激增强,表明cAMP/PKA信号通路确实参与了糖尿病视网膜病变大鼠视网膜损伤过程。此外,本研究结果还表明,低、中、高剂量EVO处理后,糖尿病视网膜病变大鼠视网膜组织中cAMP水平、p-PKA/PKA蛋白表达升高,且呈剂量依赖性,推测EVO可能通过激活cAMP/PKA信号通路改善糖尿病大鼠视网膜损伤。为了验证该推测,本研究用高剂量EVO和cAMP抑制剂SQ22536同时处理糖尿病视网膜病变大鼠,结果显示,SQ22536减弱了高剂量EVO对糖尿病大鼠视网膜损伤的改善作用。证实了猜想的正确性,即EVO可能通过激活cAMP/PKA信号通路抑制糖尿病视网膜病变大鼠视网膜神经节细胞凋亡、炎症反应及氧化应激,进而发挥对大鼠的保护作用。