马属动物3种寄生线虫的形态学扫描电镜观察

菅 蕊,徐 真,张 晛,韩爱云,吕国平,剧慧栋,5

(1. 承德医学院基础医学院,河北 承德 067000 ; 2. 河北工程大学医学部,河北 邯郸 056038 ;3. 石家庄学院化工学院,河北 石家庄 050000 ; 4. 河北中医药大学基础医学院,河北 石家庄 050000 ;5. 河北省疑难细菌研究重点实验室,河北 石家庄 050000)

马属动物曾在人类发展的历史中有过重要的贡献,至今部分马属动物仍然被作为人类食物和生物医学的实验材料。马属动物的寄生线虫严重威胁宿主的生命和健康,是引发各类疾病和死亡的重要因素。不同种类的线虫对宿主的致病机制各异,因此准确迅速地识别寄生线虫可以有效降低其对宿主的危害[1,2]。目前,多数马属动物寄生线虫有过光学显微镜的观察和描述,而该类群线虫在体前端的结构,尤其是头部乳突、口囊、内叶冠和外叶冠等结构,以及雄虫尾部的生殖锥的形态,是重要的形态学分类依据,上述结构在光镜下无法得到满意的观察结果,因此,利用扫描电子显微镜可以大幅度提高鉴定的准确性,从而对线虫的种类进行精确鉴定[3-5]。

本试验首次利用扫描电子显微镜技术对采自乌克兰的马、斑马、普氏野马和驴消化道内杯口属的不等齿杯口线虫、拉氏杯口线虫和副杯口属的麦氏副杯口线虫的体表形态进行详细观察和描述,为上述3种线虫的分类鉴定提供更精确的形态学依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 杯口属的不等齿杯口线虫、拉氏杯口线虫和副杯口属的麦氏副杯口线虫均采自乌克兰马(Equuscaballus)、驴(Equusasinus)、斑马(Equusburchelli)和普氏野马(Equusprzewalskii)的肠道内容物,用80 ℃左右的热水将虫体烫直,并将线虫保存于福尔马林中,记录宿主的种名、寄生部位、采集时间和地点。

1.2 主要材料 乳酚酸透明液(乳酸∶苯酚∶蒸馏水∶甘油=1∶1∶1∶2),乙醇(50%、70%、80%、90%和100%),0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH=7.2),戊二醛固定液(浓度2.5%),醋酸异戊酯,锇酸(浓度1%),均由河北师范大学生命科学学院动物系统学与分子进化实验室配制。

1.3 主要仪器 扫描电子显微镜(HITACHI S-4800)。

1.4 线虫的观察 将已固定的线虫标本用80%乙醇或透明液制成临时装片,在扫描电子显微镜下对线虫标本的各个部分进行初步的形态观察,查阅文献,确定线虫种类。

取保存于福尔马林中的线虫标本,用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液清洗3次,每次15 min;使用戊二醛固定液(浓度2.5%)固定3 h;然后使用0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液清洗3次,每次15 min;锇酸(浓度1%)溶液固定1 min;再用0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液清洗3次,每次15 min;再进行脱水,用乙醇作为脱水剂,按照70%、80%、90%和100%的梯度进行2次脱水,每次脱水时间为20 min;将脱水的样品放入醋酸异戊酯30 min。使用临界点干燥法进行干燥:(1)样品室预冷(注入液氮)→(2)样品放入样品室→(3)注入液态二氧化碳(样品室的70%)→(4)用二氧化碳置换样品中的醋酸异戊酯(温度调到20 ℃,压力应达到50～70 kg/cm2,保持20 min)→(5)临界处理,温度提高到40 ℃,压力应达到80～100 kg/cm2,保持5 min→(6)放气,速度在100～500 mL/min→(7)当压力低于30 kg/cm2时,切断加热器→(8)当压力为0时,取出样品,用双面胶或导电胶将样品固定在专用的样品台上,进行喷金,扫描电子显微镜下观察并拍照[6-8]。

2 结果

2.1 杯口属Poteriostomum(Quiel,1919)

2.1.1 不等齿杯口线虫P.imparidentatum(Quiel,1919) 雄虫、雌虫各观察3条,雄虫和雌虫在头端无明显差异。颈乳突刺状,长约14 μm(10～17 μm),与排泄孔大致在同一平面(图1A)。头径约205 μm(200～208 μm),口孔直径约125 μm(121～126 μm),外叶冠82枚,短小,刺状(图1B)。口领明显,在口领顶端的2个正侧方各有1个头感器,2个头感器之间对称排列着4个亚中乳突,亚中乳突基部膨大,宽约8 μm(6～11 μm),顶端尖且伸至外叶冠前缘(图1C)。头感器较扁平,基部宽约8 μm(5～10 μm)(图1D)。

图1 不等齿杯口线虫的扫描电子显微镜观察Fig.1 Scanning electron microscope observation of P. imparidentatumA:体前端; B:头部顶面观,4个近中乳突和2个头感器; C:近中乳突放大观; D:头感器放大观; E:雄虫交合伞; F:雄虫生殖锥放大观; G:雌虫尾部; H:雌虫肛门放大观A: Anterior end; B: Apical view of the head with four sub-median papillae and two amphids; C: Enlarged view of sub-median papillae; D: Enlarged view of amphids; E: Copulatory bursa of the male; F: Enlarged view of the male genital cone; G: Posterior end of the female; H: Enlarged view of the female anus

雄虫交合伞短宽,伞缘有锯齿(图1 E),生殖锥腹唇锥形,丘状凸不明显,背唇附属物发育不全,皮质领缺乏(图1 F)。

雌虫阴门开口椭圆型,宽约48 μm(42～53 μm),距肛门约598 μm(图1 G),肛门开口弧形,长约220 μm(210～232 μm),尾长约720 μm(700～750 μm)(图1 H)。

采集地点:乌克兰

宿主:斑马(Equusburchelli)、马(Equuscaballus)

2.1.2 拉氏杯口线虫P.ratzii(Kotlan,1919) 雄虫、雌虫各观察3条,雄虫和雌虫在头端无明显差异。颈乳突刺状,长约25 μm(21～28 μm),与排泄孔大致在同一平面(图2A～2C)。口领明显,与体部相接处有环状突起,头径约150 μm(138～163 μm),口孔近圆形,直径约100 μm(85～108 μm),外叶冠75枚,尖而窄,内叶冠宽度是外叶冠的2倍(图2D)。亚中乳突细长,圆锥形,基部宽约10 μm(9～11 μm),伸至外叶冠前缘(图2E)。在口领顶端的2个正侧方各有1个头感器,头感器宽而钝圆,顶端有一小孔状凹陷,基部宽约12 μm(9～14 μm)(图2F)。

图2 拉氏杯口线虫的扫描电子显微镜观察Fig.2 Scanning electron microscope observation of P. ratziiA:体前端; B:排泄孔放大观; C:颈乳突放大观; D:头部顶面观,4个近中乳突和2个头感器; E:近中乳突放大观; F:头感器放大观; G:雄虫交合伞; H:雄虫生殖锥放大观; I:雌虫尾部A: Anterior end; B: Enlarged view of the excretory pore; C: Enlarged view of cervical papilla; D: Apical view of the head with four sub-median papillae and two amphids; E: Enlarged view of sub-median papillae; F: Enlarged view of amphids; G: Copulatory bursa of the male; H: Enlarged view of the male genital cone; I: Posterior end of the female

雄虫交合伞背叶宽,伞缘锯齿状(图2G),生殖锥皮质领在生殖锥两侧,背唇上的附属物发育不全(图2H)。

雌虫阴门开口近圆形,宽约33 μm(30～36 μm),距肛门约402 μm(390～415 μm),肛门开口半月形,长约245 μm(238～255 μm),尾长约470 μm(455～480 μm)(图2I)。

采集地点:乌克兰

宿主:马(Equuscaballus)

2.2 副杯口属Parapoteriostomum(Hartwich,1986)

2.2.1 麦氏副杯口线虫P.mettami(Leiper,1913) 雄虫、雌虫各观察3条,雄虫和雌虫在头端无明显差异。颈乳突线状,长约32 μm(28～35 μm),与排泄孔大致在同一平面,排泄孔周围有一圈皮质凸起,宽约13 μm(10～15 μm)(图3A～3C)。虫体中等大小,口领明显,与体部有明显环沟隔开,头部直径约178 μm(168～185 μm),口孔直径约52 μm(45～58 μm),外叶冠尖细,75枚(图3D)。亚中乳突细长,顶端稍微膨大,长约9 μm(7～11 μm)(图3E)。在口领顶端的2个正侧方各有1个头感器,头感器裂孔状,宽约6 μm(5～8 μm)(图3F)。

图3 麦氏副杯口线虫的扫描电子显微镜观察Fig.3 Scanning electron microscope observation of P. mettamiA:体前端; B:排泄孔放大观; C:颈乳突放大观; D:头部顶面观,4个近中乳突和2个头感器; E:近中乳突放大观; F:头感器放大观; G:雄虫交合伞; H:雌虫尾部; I:雌虫阴门A: Anterior end; B: Enlarged view of the excretory pore; C: Enlarged view of cervical papilla; D: Apical view of the head with four sub-median papillae and two amphids; E: Enlarged view of sub-median papillae; F: Enlarged view of amphids; G: Copulatory bursa of the male; H: Posterior end of the female; I: Female cunnus

雄虫交合伞肋粗壮,生殖锥突出于交合伞之外,长约0.7 mm(0.65～0.75 mm),腹唇长于背唇,背唇距末端约100 μm(90～115 μm)处有突起(图3G)。

雌虫阴门开口近圆形,宽约26 μm(22～30 μm),距肛门约96 μm(85～105 μm),肛门开口弧形,长约98 μm(90～105 μm),尾长约208 μm(200～215 μm)(图3H～3I)。

采集地点:乌克兰

宿主:驴(Equusasinus)、斑马(Equusburchelli)、普氏野马(Equusprzewalskii)

3 讨论

本试验利用扫描电子显微镜首次对杯口属和副杯口属的3种线虫的体表结构进行了比较观察,杯口属和副杯口属线虫在叶冠、虫体大小和交合伞背肋的分裂方式上非常相似,其属间与种间的形态学差别主要集中在头端和生殖器,可通过口囊特征、内叶冠的插入方式和背肋的特点进行区分,在光学显微镜下很难对上述结构精确观察,在扫描电子显微镜下外叶冠的形状和数目、雄虫交合伞的形状、背肋的分列方式、生殖锥和雌虫的尾部等结构辨识清晰、立体感强,可更简单直观地对杯口属和副杯口属进行区分,有利于精确鉴定线虫的种类,结果表明,通过扫描电子显微镜观察,能发现3种线虫的外部形态特征有明显的差异。

杯口属的2个种的线虫形态在光学显微镜下非常相似,通过扫描电子显微镜更易区分,不等齿杯口线虫和拉氏杯口线虫的主要区别是内、外叶冠的特征,本试验不等齿杯口线虫外叶冠数量为82枚,不同于张路平等[1]报道的76～80枚;拉氏杯口线虫外叶冠数量为75枚,不同于Lichtenfels等[9]报道的60～70枚,与张路平等[5]报道的结果60～76枚相同。与前人光学显微镜下的观察结果相比,扫描电子显微镜提供的数据更准确具体。不等齿杯口线虫和拉氏杯口线虫的生殖锥非常相似,在光学显微镜下很难发现区别,本试验首次利用扫描电子显微镜发现其区别是不等齿杯口线虫生殖锥皮质领缺乏,而拉氏杯口线虫生殖锥皮质领在生殖锥两侧。不等齿杯口线虫和拉氏杯口线虫雌虫尾长分别约为720 μm和470 μm,其比例约为2∶1,肛门开口长约为220 μm和245 μm,与张路平等[5]对上述结构的测量相比,使用电子扫描显微镜测量的结果精确度得到了大幅度提高。

本试验测定的麦氏副杯口线虫外叶冠数目为75枚,不同于Lichtenfels等[9]报道的60枚和张路平等[5]报道的62～68枚;雄虫交合伞肋粗壮,生殖锥突出于交合伞之外,长约0.7 mm,背唇突起距末端约0.1 mm;雌虫阴门与肛门距离较近,肛门开口较不等齿杯口线虫和拉氏杯口线虫小,约为98 μm;对上述结构详细的观察和测量尚属首次。

终上所述,本试验利用扫描电子显微镜对3种马属动物寄生线虫进行了观察,认为扫描电镜图谱辨识清晰,立体感强,更简单直观,扩大了不等齿杯口线虫和麦氏副杯口线虫外叶冠数目的区间,精确观察了杯口属雄虫生殖锥的皮质领,增加了许多有意义的数据,为精确鉴定上述3种线虫提供参考依据。