PD-1/PD-L1 参与骨髓间充质干细胞归巢修复慢阻肺大鼠的肺损伤

林志凤，王志红*，陈燕辉，施佳恒，王宇潇，徐忠敏，石永斌，林丹婕

（1 福建中医药大学中西医结合学院，福州 350122；2 福建医科大学省立临床医学院 福建省立医院血液科，福州 350001；3 福建医科大学临床医学部，福州 350000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）作为一型常见的慢性肺部疾患，以进行性不完全可逆的气流受限为主要特征，现有的临床治疗方案无法改善患者肺功能的长期下降和死亡率[1]。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）能分化成多种细胞类型，并用于再生肺实质和气道结构，干细胞治疗是一种有潜力恢复COPD患者肺功能和提高生活质量的治疗策略[2]。然而，良好的归巢能力是干细胞发挥治疗作用的前提，归巢效率的提高对于优化治疗效果至关重要[3]。

程序性死亡蛋白配体 1（programmed death ligand-1, PD-L1）及其受体程序性死亡蛋白1 （programmed death-1, PD-1) 是免疫调节和免疫治疗的关键分子，除了参与免疫应答外，表达于MSCs 上的PD-L1 参与MSCs 的迁移过程[4]，沉默胆囊癌细胞内 PD-1 基因能抑制细胞的侵袭转移能力[5]，PD-1 与PD-L1 均被证明在细胞迁移过程中发挥重要作用。结合既往研究损伤肺组织中PD-1 表达增高[6,7]，MSCs 表达PD-L1[8]，本研究通过建立COPD 肺损伤大鼠模型，探讨PD-1/PD-L1 在细胞迁移过程中的作用及对骨髓来源MSCs 归巢作用的影响，以期为MSCs 的临床治疗提供一定的思路。

材料与方法

1 实验动物

实验用6～8 周龄SPF 级SD 大鼠，雌雄各半，体重120～150 g，用于造模及分离骨髓间充质干细胞，实验动物购自福建医科大学动物实验中心（动物编号：SYXK 闽2012-001）。实验前适应性饲养1 周，常规饲喂，自由进食、饮水，饲养环境温度、湿度适宜，通风良好，所有实验动物相关处置均按照动物实验伦理要求进行。

2 主要试剂和仪器

DMEM 培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco 公司）；荧光标记的单克隆抗体（eBioscience 公司）：CD34-PE、CD44-PE、CD29-FITC、CD45-FITC；绿色荧光蛋白(GFP)腺病毒载体（上海吉凯基因化学技术有限公司）；大鼠 PD-1 蛋白（Sino Biological）；抗PD-L1 抗体（BioXcell 公司）；丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成）；SOD 试剂盒（南京建成）；流式细胞仪（Bection Dickinson 公司）；倒置荧光显微镜（Olympus 公司）；酶标仪（Bio-Tek 公司）。

3 MSCs 的制备与鉴定

取SD 大鼠双侧股骨，充分暴露骨髓腔，取DMEM 培养基反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液，离心后弃上清；加入含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基重悬细胞，以2×106个细胞接种于培养瓶，置于 37 ℃、5% CO2培养箱培养。原代细胞贴壁生长达80%左右时进行传代，原代细胞记作P0，传第一代记作P1，依次类推。取P3 代细胞，经胰酶消化后，制备成细胞悬液，分别加入CD34-PE、CD44-PE、CD29-FITC、CD45-FITC 的荧光标记抗体，并设置同型抗体对照，室温下避光孵育30 min，应用流式细胞仪检测MSCs 表面标志。向生长到融合度80%的P3 代细胞，分别加入成脂、成骨诱导培养基，21 d 后，油红O 染色进行成脂鉴定，碱性磷酸酶染色进行成骨鉴定。

4 动物模型创建与评价

大鼠适应性喂养1 周后，采用烟气暴露法，在染毒箱中全烟气暴露2 h/d，10 支烟1 次，每支烟燃吸12 min，吸烟机抽吸频率1 次/min，每周6 次，连续暴露4 个月，以制作大鼠COPD 模型，模型的制备由实验室协助完成。观察大鼠毛发、饮食、行动等结合丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）可用作COPD 模型评价指标[9]，根据相应试剂盒说明检测正常及COPD 大鼠血清MDA 及SOD 含量。

5 MSCs 治疗与疗效评价

5.1 GFP 标记MSCs

取P3 代细胞行绿色荧光蛋白（GFP）标记，培养体系加入病毒液（Ad-GFP滴度为3.0×1010PFU/mL），以110 PFU/cell的剂量加入培养瓶中。每隔30 min振荡1 次，共3 次。在荧光显微镜下观察标记情况。GFP 转染MSCs 后，以未标记的 MSCs 做对照，用流式细胞仪进行荧光标记率检测。

5.2 GFP 标记MSCs 的归巢

实验分为正常和CODP 模型组，每组10 只，收集GFP 标记的MSCs，胰酶消化后计数，制成3×106的细胞悬液，经尾静脉分别注射入正常和CODP 模型大鼠体内。于MSCs 注射后第7 d，戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，取出肺组织制作冰冻切片，荧光显微镜下观察GFP 阳性细胞的分布并拍照。按照每个部位 5 个视野，每只鼠共计数 5 个部位，计算每只鼠肺内绿色荧光信号数量，以x±s表示。

5.3 HE 染色观察各组肺组织病理变化

实验总共为3 组：①正常对照组，正常SD 大鼠通过尾静脉给予生理盐水，注射2 周；②COPD 模型组，通过尾静脉给COPD 模型大鼠注射生理盐水，注射2 周；③MSCs 治疗组：通过尾静脉给COPD模型大鼠注射MSCs 细胞，每周1 次，每次3×106个细胞，注射2 周。上述干预措施完成后，取大鼠肺脏一部分用作PCR 检测各组肺组织中PD-1 mRNA的表达，另一部分制作石蜡切片，再行HE 染色，观察各组病理变化。每张病理切片随机选取5 个视野用数码相机进行采像，并用Metamorph 图像分析软件（美国 Universal Imaging Corporation）分析肺组织结构的形态学变化，测量平均肺泡面积及肺泡吸光度（OD）值，并进行统计学分析。

6 PD-1 mRNA 在各组大鼠肺组织中表达的qRTPCR 检测

实验动物分为对照组、COPD 模型组和MSCs 治疗组，取每组大鼠的一部分肺脏组织，将组织匀浆后采用Trizol 一步法提取组织总RNA，按照反转录试剂盒说明合成cDNA。以cDNA 为模板，进行PCR 扩增。2－△△Ct法计算目标引物 mRNA 的相对表达量。依据NCBI 数据库中大鼠PD-1以及内参β-actin 基因序列，引物设计合成采用Primer5.0 引物设计软件（表1）。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 Sequences of primers for RT-PCR

7 MSCs 上PD-L1 mRNA 表达的RT-qPCR 检测

取P3 代MSCs 和P3 代MSCs 培养上清液，用Trizol 一步法提取总RNA。按照反转录试剂盒说明合成cDNA，以cDNA 为模板，进行PCR 扩增 。2－△△Ct法计算目标引物 mRNA 的相对表达量。依据NCBI 数据库中大鼠PD-L1 以及内参β-actin 基因序列，应用Primer5.0 引物设计软件进行引物设计合成（表1）。

8 PD-1 和PD-L1 在MSCs 向肺迁移中作用的Transwell 分析

取P3 代的MSCs，经胰蛋白酶消化后，用无血清的DMEM/F12 培养基重悬，制备成2×106个/mL的细胞悬液，取200 μL 添加到上室。根据下室成分不同分为3 组：空白对照组，下室加入600 μL 完全培养基 ( 含10% 胎牛血清和 1%双抗的 DMEM/F12培养基 )；PD-1 组：下室加完全培养基及PD-1 蛋白（2 ng/μL）；PD-L1 抗体组：下室加完全培养基及PD-1 蛋白（2 ng/μL），同时上室加PD-L1 抗体（2 ng/μL）。培养36 h 后，取出小室，弃掉培养液，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗，用0.1%结晶紫染色3 ～4 h，PBS 清洗，用棉棒轻轻擦去小室内未穿过小室膜的细胞，晾干后于倒置显微镜观察小室膜外层细胞，随机选取5 个视野进行细胞计数并拍照，分析MSCs 的相对迁移数量。

9 统计学分析方法

软件用SPSS 25.0，计量资料以x±s表示，两组均数比较用两独立样本t检验；多组间均数比较用单因素方差分析 (One-way ANOVA)，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 MSCs 形态学观察及鉴定

采用贴壁法培养的骨髓来源的MSCs，24 h 后部分细胞可见贴壁；3 ～4 d 后即可观察到一些小的集落形成。原代细胞贴壁生长，呈长梭形，以多个克隆集落方式增长繁殖，7～14 d 即可观察到克隆集落部分融合成片（图1A）。传代后的MSCs，细胞贴壁较P0 代培养的细胞快，24 h 即可观察到细胞完全贴壁，形态与P0 代细胞相似，传代后MSCs 均匀分布，形态呈单一的梭形。流式细胞仪检测结果表明MSCs 上CD29、CD44 表达率较高（图1D、E），CD34、CD45 表达率较低（图1F、G）。加入成脂诱导培养基后21 d，油红O 染色可见呈深橙红色的脂滴（图1B）；成骨诱导分化21 d 后，经碱性磷酸酶染色可见典型的成骨表现（图1C）

图1 MSCs 的培养及鉴定。A，MSCs 原代细胞成纤维样集落方式增殖；B，MSCs 成脂诱导后油红O 染色；C，MSCs 成骨诱导后碱性磷酸酶染色；D-G，MSCs 表面CD29（D）、CD44（E）、CD34（F）和CD45（G）表达的代表性流式细胞术检测Fig. 1 Culture and identification of MSCs. A, fibroblast-like colony proliferation of MSCs primary cells; B, Oil Red O staining of MSCs after lipogenic induction; C, alkaline phosphatase staining of MSCs after osteogenesis induction; D to G, representative assay by flow cytometry of the expressions of CD29 (D), CD44 (E), CD34 (F) and CD45 (G) on the surface of MSCs

2 慢性阻塞性肺疾病模型鉴定

造模结束后，正常对照组大鼠精神状态较好，毛发有光泽，呼吸平稳，无气促，饮食及睡眠正常。COPD 模型组大鼠则出现精神萎靡，毛发干枯发黄，呼吸急促，咳嗽等症状，而且进食饮水量减少，睡眠质量较正常组欠佳。相对于正常组，COPD 模型组血清SOD 水平低于对照组，MDA 含量高于对照组（表2）。

表2 大鼠肺中超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平的变化（n=8）Tab. 2 Changes of SOD and MDA levels in lungs of rats (n=8)

3 MSCs 在肺组织的示踪及MSCs 输注后病变肺组织的损伤修复

向MSCs 中加入携带GFP 的腺病毒， 3 h 后在荧光显微镜下开始出现稀少的微弱绿色荧光；24 h后大部分细胞被转染，呈较强的绿色荧光。48 ～72 h 阳性细胞逐渐增多，MSCs 细胞几乎全部转染，并且强度增强，多为明亮的绿色荧光（图2A），转染效率约 80%左右，空白对照组未见荧光表达。GFP标记的MSCs 输注至正常及COPD 模型大鼠后7 d，COPD 大鼠肺组织中绿色荧光蛋白标记的MSCs 明显多于正常大鼠（图2B、C，表3）。

图2 GFP 标记MSCs 归巢。A，转染GFP 腺病毒 3 d 后的MSCs；B，正常大鼠肺内GFP 标记的MSCs；C， COPD 大鼠肺内GFP 标记的MSCsFig. 2 Homing of MSCs labeled with GFP. A, MSCs transfected with GFP adenovirus for 3 days; B, GFP-labeled MSCs in the lungs of normal rats; C,GFP-labeled MSCs in the lungs of COPD rats

表3 大鼠肺内MSCs 归巢的定量分析（n=10）Tab. 3 Quantitative analysis of MSCs homing in the rat lungs (n=10)

对大鼠肺组织HE 染色显示：正常对照组中肺泡大小均匀，肺泡壁无明显增厚，肺泡腔干净、匀称，边缘无大量炎细胞浸润及部分肺间隔断裂（图3A）；在COPD 模型组中，镜下见病变支气管壁明显增厚，增生的粘膜突向管腔，间质内可见大量淋巴细胞和浆细胞浸润，同时管壁内有平滑肌束增生、肥大。观察结果提示COPD 模型制备良好（图3B）。MSCs 治疗组中，与COPD 模型组比较，支气管壁较之变薄，间质中淋巴细胞、浆细胞等慢性炎症细胞减少，细支气管和肺泡结构正常化，新肺泡结构形成。COPD 模型肺组织平均肺泡面积较正常对照组明显增大，OD 值明显减少；MSCs 治疗组平均肺泡面积较COPD 模型组明显减小，OD 值明显增大（表4）。结果提示，MSCs 治疗后COPD 肺损伤有所改善（图3C）。

图3 大鼠肺组织病理变化HE 染色检测。A，对照组；B，COPD 模型组；C，MSCs 治疗组；比例尺，100 μmFig. 3 Examination by HE staining of lung tissue pathological change of the rats. A, Control Group; B, COPD Model Group; C, MSCs treatment Group;scale, 100 μm

表4 肺组织平均肺泡面积与OD 值定量分析（n=5）Tab. 4 Quantitative analysis of the average alveolar area and OD value of the rat lung tissues (n=5)

4 MSCs 治疗减少COPD 模型大鼠肺组织中PD-1 mRNA 表达的上调

qRT-PCR 检测显示：COPD 模型组的肺脏组织PD-1 mRNA 表达水平较对照组明显升高，MSCs 治疗组大鼠肺组织中PD-1 mRNA 表达水平明显低于COPD 模型组，与对照组相近（图4）。

图4 大鼠肺脏组织中PD-1 mRNA 表达水平的RT-qPCR 检测。aP＜0.0001；bP＜0.0001；n=6Fig. 4 qRT-PCR detection of expression levels of PD-1 mRNA in the lung tissue of the rats. aP＜0.0001; aP＜0.0001; n=6

5 PD-L1 mRNA 在MSCs 的表达

qRT-PCR 结果显示， MSCs 组的PD-L1 mRNA表达明显高于MSCs 上清液组（P＜ 0.0001）（图5）。

图5 MSCs 上清液与MSCs PD-L1 mRNA 水平比较。Sup，MSCs 培养上清组；MSCs，MSCs 组；aP＜0.0001；n=8Fig. 5 Comparison of levels of PD-L1 mRNA in MSCs supernatant and MSCs. Sup, supernatant group; MSCs, MSCs group; aP＜0.0001; n=8

6 PD-1 促进MSCs 定向迁移（归巢）

Transwell 实验显示：与对照组相比，PD-1 蛋白存在时，MSCs 迁移数量明显增多；与PD-1 组相比，在PD-L1 抗体存在时，MSCs 迁移数量明显减低（图6，表5）

图6 PD-1 及PD-L1 抗体对MSCs 迁移能力影响的结晶紫染色分析。A，对照组；B，PD-1 组；C，PD-L1 抗体组；比例尺，400 μmFig. 6 Crystal violet staining assay for the effect of PD-1 and PD-L1 antibody on the migration ability of MSCs. A, Control Group; B, PD-1 Group; C,PD-L1 antibody Group; scale, 400 μm

表5 PD-1 及PD-L1 抗体对MSCs 迁移能力影响的定量分析Tab. 5 Quantitative analysis of the effects of PD-1 and PD-L1 antibody on the migration ability of MSCs

讨 论

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种终生疾病，目前主要的治疗手段包括戒烟、定期服药、接受肺部康复训练等，COPD 的症状有时会改善，然而，肺部受损永远无法完全恢复正常[10]。MSCs具有免疫调节、抗炎、修复的功能[11]，已被证实在COPD 发生时能够定向迁移到损伤肺部，并在受损的肺部分化为肺上皮细胞和内皮细胞等，发挥组织损伤修复作用，还能在损伤局部反应性分泌一些生长因子和细胞因子，这些因子可能起到治疗甚至是中断COPD进行性发展的作用[12]。本实验结果表明，与COPD模型组相比，注射MSCs 治疗后大鼠肺支气管壁变薄，间质中淋巴细胞、浆细胞等慢性炎症细胞减少，细支气管和肺泡结构正常化，新肺泡结构形成。与过往研究结果一致[13,14]，本研究结果证实了MSCs治疗COPD 的可行及有效性。然而，MSCs 归巢到损伤部位的效率，很大程度上影响其治疗作用的发挥。当前用于改善MSCs 归巢的各种策略，包括遗传修饰，细胞表面工程，MSCs 的体外启动，特别是超声技术的应用等[15]。对归巢相关分子机制的了解，能帮助我们改善MSCs 的归巢率。

MSCs 的归巢是指其被“截留”在组织血管中，随后穿越内皮细胞进入靶组织的过程，具体包括MSCs 与内皮细胞的活化-动员、MSCs 在血管内皮上结合-滚动、MSCs 向血管内皮黏附-穿越内皮细胞，最终进入靶组织[16]。MSCs 向损伤肺组织归巢的部分原因是损伤组织释放的一些趋化因子，同时表达特异性的受体或配体，引导MSCs 归巢，此外MSCs 也会表达一些趋化因子受体，释放一些细胞因子，在MSCs 归巢过程中发挥作用。本研究发现，正常大鼠肺组织低表达PD-1，而COPD 肺组织高表达PD-1，同时对正常及COPD 大鼠同时输注GFP 标记的MSCs，发现COPD 组大鼠肺部荧光信号明显强于正常组，表明PD-1 高表达与MSCs 顺利归巢至肺组织存在一定的相关性。

本次实验体外分离纯化的MSCs 上有PD-L1 表达，因此我们提出设想，COPD 损伤肺组织中高表达的PD-1，可能作为一种趋化性刺激，从而促进MSCs的定向迁移过程，这一迁移过程，一定程度上依赖于肺组织中高表达的PD-1 与MSCs 表面的PD-L1 特异性结合而实现的。体外Transwell 迁移实验结果显示，与对照组相比，PD-1 存在时，MSCs 可向其定向迁移，当加入PD-L1 抗体后，由于MSCs 表面的PD-L1 与PD-L1 抗体结合被部分封闭，使与PD-1 结合的MSCs 表面暴露的PD-L1 减少，进而使MSCs迁移数目明显降低。这也证实了PD-1 引起MSCs 定向迁移依赖于MSCs 的PD-L1 表达，这一迁移过程可被PD-L1 抗体特异性阻断。以上均表明PD-1/PDL1 在参与MSCs 归巢过程中发挥了一定的作用。

目前对于MSCs 定向归巢以及PD-1/PD-L1 信号通路促进肿瘤发生免疫逃逸的相关研究较多，但关于PD-1/PD-L1 信号通路参与MSCs 定向归巢的相关报道罕见。MSCs 归巢是个复杂的过程，本次实验证明PD-1/PD-L1 参与了MSCs 定向归巢到COPD 大鼠肺部的过程，但具体是在MSCs 活化-动员，结合-滚动，还是黏附-穿越血管内皮细胞的哪个环节中发挥作用尚待进一步的研究。另外PD-1 在肺组织中高表达，具体是在肺的实质细胞还是肺内的免疫细胞中表达，后续可对COPD 肺组织中的细胞分离后进一步研究。

综上所述，本研究证实体外PD-1 可促进MSCs定向迁移，当加入PD-L1 抗体封闭部分MSCs 上表达的PD-L1 后，MSCs 定向迁移明显减少。相比于正常肺组织，高表达PD-1 的COPD 肺组织伴随MSCs更高的归巢率，本实验提供了一个全新的角度，关于PD-1/PD-L1 在MSCs 归巢过程中的作用。