miR-31 通过下调FIH 和上调VEGF-A/VEGFR-2促进大鼠主动脉内皮细胞增殖

李咏梅，付媛，曹利利，杜若琛，王春芳*，张轩萍*

（1 山西医科大学生理学系细胞生理学教育部重点实验室，太原 030001；2 山西医科大学基础医学院药理学教研室，晋中 030619；3 山西医科大学实验动物中心，太原 030001）

心血管疾病是全世界最常见的死亡原因之一，近年来，尽管进行了积极的预防工作，但心血管疾病的发病率依旧呈上升趋势[1]。内皮是一个连续的屏障，其表面直接与体内几乎每个系统相互作用[2]。血管内皮细胞位于血浆与血管组织之间，对血管内皮功能及血管稳态直接造成影响，血管内皮功能障碍与广泛心血管疾病直接相关[3,4]。主动脉内皮细胞是探索血管内皮功能特性的重要载体，大量研究采用了大鼠主动脉内皮细胞（rat aortic endothelial cells,RAECs），在体外培养中通过各种刺激模拟不同病理条件时在体内的状态，进而高效、便捷的分析病理机制，为开发防治心血管疾病的策略奠定了重要的基础[5]。在本文中，首先在国内外方法的基础上建立原代RAECs 的分离培养方法。

血管生成是维持正常组织生理的关键过程，通过形成新的血管网络参与组织重塑和再生[6]。微小核糖核酸（microRNAs, miRNA）在不同物种间是保守的，miR-31 是一种亟待进一步研究的短链非编码RNA，是一种关键的基因表达调节因子[7]。缺氧诱导因子抑制因子（hypoxia inducible factor inhibitor, FIH）被证明与血管生成密切相关，且被证明是miR-31 的直接靶标[8,9]。FIH 被证明会调节血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGF-A），表现为FIH 的消耗会诱导VEGF-A 的表达[10]。VEGF-A 诱导血管内皮细胞的增殖，与血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2）结合，进而促进血管生成[11]。因此，我们以RAECs 为研究对象，探究miR-31 对其功能的影响及作用机制，对于内皮功能障碍相关的心血管疾病中有重大临床意义。

材料与方法

1 实验动物

12只1月龄SPF 级SD大鼠，体重约为100～120 g，雌雄不限，购自山西医科大学实验动物中心【SCXK（晋）2019-0005】，饲养于山西医科大学实验动物中心屏障环境中【SYXK（晋）2019-0007】。昼夜各半循环照明，湿度恒定，温度控制在 22～25 ℃，洁净通风，自由进食饮水。所有实验操作均符合实验动物伦理学要求（审批号：SYDL2021016）以及中华人民共和国《实验动物管理条例》。

2 主要试剂与仪器

Ⅰ型胶原酶（Macklin，C909787），胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%，Solarbio，T1300），兔抗CD31抗体、兔抗vWF 抗体、兔抗CD34 抗体（BOSTER，PB9273、PB9273、PB9053），Cy3 标记的miR-31 激动剂/抑制剂（miR-31 agomir/antagomir，广州锐博，R10034.9），转染试剂（INTERFERin®，Polyplus，PT-409-01），miRNA 第一链合成试剂盒（Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit，Takara，638313），兔抗FIH 抗体、兔抗VEGF-A 抗体、兔抗VEGFR-2 抗体（ABclonal，A5466、A12303、A5609），HRP-标记的山羊抗兔IgG H&L（Abacam，ab6721），Hoechst 33258 染色液（Boster，AR1169）。倒置显微镜和荧光显微镜（OLYMPUS，日本），电泳仪、转膜仪和高灵敏度化学发光成像系统（Bio-Rad，美国）。

3 大鼠主动脉内皮细胞原代培养

腹腔注射戊巴比妥钠（150 mg/kg）以麻醉大鼠，75%乙醇喷洒胸部和腹部消毒。打开大鼠胸腹腔，切开髂总动脉分支处放血，左心室注射预冷磷酸盐缓冲液（PBS）灌注主动脉。沿着脊柱将心脏、主动脉及在外附着的结缔组织和脂肪分离出来，直至髂总动脉分支处，并将其置于含2%青霉素-链霉素的无菌PBS 中，移至超净工作台内，换液2 次，漂洗表面残留血渍，在解剖显微镜下逐步用剪刀、镊子将主动脉剔除干净。将剔除干净的主动脉移入不含双抗的无菌PBS 后纵行剖开，尽量不把主动脉断开，在6 cm 直径单孔培养皿中配制1∶1 的 2 g/L 胶原酶及胰酶的混合消化液，将剖开的主动脉展开放入消化液，培养箱中消化15 min。取出培养皿，加入相同体积含有20% FBS 的培养基终止消化过程，肉眼下用弯镊将血管内膜轻轻刮拭几次，使内皮细胞脱落，力度以不使血管断裂为度。培养基或无菌PBS 冲洗后弃去血管，收集培养皿中液体，离心后弃上清，重悬细胞，吹打分散后用移液器均匀转移至6 孔板的两孔内，于含20% FBS 的DMEM 培养基在培养箱中培养（表1）。培养1 d 后换液，去除未贴壁的细胞；其后每隔2 d 半定量换液1 次，待细胞融合成片，即可传代培养。

表1 大鼠主动脉内皮细胞的原代培养方法Tab.1 Primary culture method of rat aortic endothelial cells

4 目的细胞传代培养

待6 孔板中培养的原代细胞融合度达到90 %以上时，用0.25 %胰蛋白酶-EDTA 消化液消化细胞。重悬后将1 个6 孔板孔内的细胞接种于1 个T25 培养瓶，继续培养。每2～3 d 换液，细胞融合度达85%以上时进行传代或后续实验，定时观察并记录细胞生长状态。

5 CD31、vwF 和CD34 免疫荧光染色

取第2 代近融合的内皮细胞，消化后接种至6孔板，4%多聚甲醛固定、0.5% Triton X-100 室温通透，正常山羊血清封闭后滴加抗体（1∶200）于4 ℃过夜。加入荧光二抗（1∶400）、0.1% Hoechst 避光孵育，封片后荧光显微镜下观察。

6 细胞分组及细胞转染

取第2 代近融合细胞进行实验，将细胞分为3组，对照（Control）组、miR-31 激动剂（miR-31 A）组和miR-31 抑制剂（miR-31 An）。接种细胞后添加含有FBS、无双抗的培养基，当细胞融合度达到30%～50%时，转组染miR-31 agomir 和antagomir（终浓度分别为50 nmol/L 和100 nmol/L）。转染细胞12 h 后，4%多聚甲醛固定、0.1% Hoechst 避光孵育，在荧光显微镜下观察。

7 细胞增殖检测

取第2 代近融合的内皮细胞接种于96 孔板（10000 个细胞/孔），将CCK-8 溶液与培养基1∶9混合，每孔加100 μL 混合液，孵育2 h 后检测在450 nm 处吸光度。转染细胞后连续3 d 测定吸光度。

8 实时荧光定量逆转录PCR（RT-qPCR）

转染细胞后，使用Trizol 法从细胞中提取总RNA，按照说明书将miR-31 反转录成cDNA，以cDNA 为模板进行扩增。在95 ℃预变性1 min；95℃15 s，60 ℃ 1 min 进行40 个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s 和60 ℃ 15 s 建立熔解曲线。相对miRNA 表达水平以U6 为参考基因，根据公式2-ΔΔCt进行计算。PCR 引物序列见表2。

表2 PCR 引物序列Tab. 2 Primer sequences for PCR

9 蛋白质免疫印迹

提取细胞中的总蛋白并测定蛋白浓度。SDSPAGE 凝胶电泳，转膜、封闭后，与抗FIH（1∶1000）、抗VEGF-A（1∶1000）、抗VEGFR-2（1∶1000）及抗β-actin（1∶2500）一抗，4 ℃过夜。次日，与相应的HRP 标记的二抗（1∶5000）室温下孵育60 min。使用ECL 发光试剂检测条带，使用Image Lab 软件进行分析。

10 统计学方法

实验数据采用IBM SPSS Statistics 26 软件统计分析，采用GraphPad Prism 8.3.0软件作图。数据表示为±s表示，组间比较运用单因素方差分析（oneway ANOVA），以P＜0.05 表示两组间差异具有统计学意义。

结 果

1 大鼠主动脉内皮细胞原代与传代培养与鉴定

原代培养1 d 时细胞贴壁，镜下观察到单个散在分布的内皮样细胞，可看到短梭形或多角形细胞形态；培养3～4 d 时细胞变密集，逐渐融合成片，偶见接触抑制现象；培养5 d 时，细胞生长旺盛并连接成片，边缘部分广泛出现接触抑制现象；培养7～8 d 时，细胞融合度达到90%以上，贴壁细胞铺满培养瓶底面，呈典型的单层、三角形、卵型不规则形状，主要见铺路石样单层镶嵌排列（图1）。

图1 原代培养1 d （A）、3 d（B）、5 d（C）和7 d（D）的大鼠主动脉内皮细胞的形态特点。比例尺，100 μmFig. 1 Morphological characteristics of the rat aortic endothelial cells in primary culture for 1 day (A), 3 days (B), 5 days (C) and 7 days (D). Scale bar,100 μm

第2 代细胞接种1 d 时，可见到梭形或多角形的内皮样细胞均匀散在分布；3～4 d 时，细胞可铺满培养瓶底面，呈典型的单层、铺路石样镶嵌式排列（图2）。培养至第5 代时仍能看到典型的内皮细胞形态。

图2 传代培养1 天（A 和B）和3 天（C 和D）的大鼠主动脉内皮细胞的形态特点。比例尺，A、C，100 μm；B、D，50 μmFig. 2 Morphological characteristics of the rat aortic endothelial cells subcultured for 1 day (A and B) and 3 days (C and D) in subculture. Scale bar,100 μm in A and C, 50 μm in B and D

免疫荧光染色显示，传代培养第3代的细胞在细胞膜上和细胞质中均呈CD31、vwF 和CD34 阳性，免疫荧光标记阳性率达98%以上（图3）。

图3 CD31、vwF 和CD34 在传代培养第3 代大鼠主动脉内皮细胞中表达的免疫荧光检测。比例尺，25 μmFig. 3 Immunofluorescent examination of expressions of CD31, vwF and CD34 in subcultured rat aortic endothelial cells at passage 3. Scale bar, 25 μm

2 miR-31 促进主动脉内皮细胞增殖

在传代培养第3 代的主动脉内皮细胞转染miR-31 agomir 或miR-31 antagomir 后，细胞核周围可见红色荧光，表明miR-31 agomir 或miR-31 antagomir 转染成功，阳性率均达97%以上（图4A）。RT-qPCR 检测显示，转染agomir 后 miR-31 含量明显升高，转染antagomir 后miR-31 含量明显下降（图4B），表明miR-31 agomir/miR-31 antagomir 能有效上调/下调miR-31 的表达。

图4 第3 代大鼠主动脉内皮细胞miR-31 agomir/antagomir 转染效率与作用效果分析。A，荧光显微镜观察miR-31 agomir/antagomir 转染效率；比例尺，50 µm。B，RT-qPCR 检测miR-31 agomir (A) / antagomir (An)对miR-31 表达的影响；与Control 组相比，**P ＜ 0.01；n=6Fig. 4 Analysis of transfection efficiency and efficacy of miR-31 agomir/antagomir in subcultured rat aortic endothelial cells at passage 3. A, fluorescence microscopic observation of miR-31 agomir/antagomir transfection efficiency; scale bar, 50 µm. B, RT-qPCR detection of the effect of miR-31 agomir/antagomir on expression of miR-31; **P ＜0.01, compared with control group; n=6

转染细胞后，定时在显微镜下观察细胞形态。在转染后1 d 时，可观察到miR-31 agomir 和antagomir转染对主动脉内皮细胞有一定的毒性作用，出现细胞漂浮现象。继续培养，对照组细胞生长旺盛，在第2 d 时可见广泛的细胞接触抑制现象；miR-31 agomir组细胞生长较慢，在第3 d 时仍可观察到较多的间隙。CCK-8 分析显示，与Control 组相比， miR-31 agomir 组于转染后1 d 起，细胞增殖速度明显加快；miR-31 antagomir 组在转染后第2、3 d 时，细胞增殖速度明显下降。由此表明miR-31 促进主动脉内皮细胞增殖（图5）。

图5 改变miR-31 表达对大鼠主动脉内皮细胞增殖影响的CCK-8 检测。与对照组比较：*P＜0.05，**P ＜0.01；n=6Fig. 5 CCK-8 assay of the effect of changing miR-31 expression on proliferation of the rat aortic endothelial cells. *P ＜0.05, **P ＜0.01,compared with Control; n=6

3 miR-31 下调FIH 且上调VEGF-A 和VEGFR-2

蛋白质免疫印迹分析表明，与对照组主动脉内皮细胞相比，转染miR-31agomir 的主动脉内皮细胞FIH 水平明显下降，VEGF-A 和VEGFR-2 水平明显升高；miR-31 antagomir 的主动脉内皮细胞FIH 水平明显升高，VEGF-A 和VEGFR-2 水平则明显降低（图6），由此表明，在主动脉内皮细胞中，miR-31能下调FIH 水平，上调VEGF-A 和VEGFR-2 水平。

图6 改变miR-31 表达对大鼠主动脉内皮细胞内FIH、VEGF-A 和VEGFR-2 水平影响的免疫印迹分析。A，大鼠主动脉内皮细胞内FIH、VEGF-A 和VEGFR-2 水平的代表性免疫印迹检测。B，大鼠主动脉内皮细胞内FIH、VEGF-A 和VEGFR-2 水平的定量分析；与对照组相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；n=3Fig. 6 Immunoblotting analysis of the effects of changing miR-31 expression on the levels of FIH, VEGF-A, and VEGFR-2 in the rat aortic endothelial cells. A, representative immunoblotting detection of FIH, VEGF-A, and VEGFR-2 levels in the rat aortic endothelial cells. B, quantitative analysis of FIH, VEGF-A, and VEGFR-2 levels in the rat aortic endothelial cells; *P ＜0.05, **P ＜0.01, compared with Control; n=3

讨 论

心血管疾病是一种有严重危害性的疾病，在全球尤其在发展中国家，是人们死亡的主要因素[2]。由于血管内皮细胞直接与循环血液接触，因此很容易受到血液中活性物质的影响[3]。越来越多的证据表明，血管内皮功能障碍是与血管收缩、血栓形成和炎症状态相关的疾病，例如高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭、心肌梗死和中风等广泛心血管疾病的标志[4]。

微小RNA（miRNAs）在不同物种之间是保守的[7]。miRNAs 可以在转录后水平上负调节其靶基因，参与调节血管功能等重要的生命过程[8]。研究表明miR-31 可直接靶向FIH，影响细胞增殖、迁移及血管形成过程[9]。高水平的miR-31 会导致体外毛细血管样小管形成增强[12]。此外，研究发现FIH 与VEGF 密切联系，添加VEGF-A 可以减轻由FIH 过度表达引起的血管缺陷[10]。VEGF-A 是维持正常组织生理的关键基因，通过与VEGFR-2 相互结合，参与到血管张力控制、血管生成的一系列过程[13]。在心血管疾病中，活性氧物种（ROS）、氧化脂质等在血管部位的累积会进一步增强VEGF-A 和VEGFR-2的产生，共同导致血管生成[14]。因此，本文在细胞水平上探究miR-31 对RAECs 功能及FIH/VEGF 通路的影响，对于广泛的心血管疾病可能会产生有利的启示。

目前，国内外的原代RAECs 分离培养方法分为植块法及植块法联合消化法，在内皮翻转后结扎烧焦、整体植块法中，使用了缝线、缝合针、加热钳、鼠尾胶包被[15]；在内皮外翻或剖开、血管段或组织块植块法中，使用了眼科显微器械[16]；在主动脉环植块法中，使用了明胶包被、含肝素的PBS 灌注[17]；在内皮外翻、消化压片法中，使用了眼科显微器械、显微针、明胶包被[18]，且均另外添加了内皮细胞生长因子、肝素、胰岛素等营养因子，达近融合状态时间在7 ～14 d 不等。本文建立了原代大鼠内皮细胞的分离培养方法，并揭示了miR-31 对RAEC细胞功能的积极作用，可能与血管生成相关的FIH /VEGF-A / VEGFR-2 通路相关。在不进行包被处理、无特殊器械、不添加昂贵营养因子的情况下，成功培养了原代及传代RAECs。而后，通过观察miR-31对RAECs 增殖的作用，以及测定细胞中miR-31 与FIH、VEGF-A 和VEGFR-2 这些血管生成相关通路中关键分子的表达情况，来探索miR-31 对RAEC功能的影响及其潜在机制。结果表明，miR-31 使细胞增殖明显加快，下调FIH 水平，上调VEGF-A 和VEGFR-2 水平，由此提示miR-31 促进RAEC 细胞增殖可能是通过下调FIH、上调VEGF-A 和VEGFR-2实现的。

在之后的研究中，可以在细胞水平上和动物水平上验证miR-31 是否直接靶向FIH，关注于FIH 参与调节的下游因子，还可以在广泛的心血管疾病中进行相关机制的探索。此次研究将miR-31 与内皮细胞联系起来，为开发心血管疾病的新型治疗策略提供了新思路。