电化学生物传感器及其在现代军事医学中的应用

金定都,方寒寒综述,叶宗煌,高 涛审校

0 引 言

电化学生物传感器使用固定化的生物体(细胞器、细胞、组织等)或者生物大分子物质(酶、抗原、抗体、DNA等)作为敏感元件,利用电化学原理检测和分析所得信号[1]。电化学生物传感器具有诸多优点,例如响应快、灵敏度高、专一性强、检测范围广等,可检测物质包括中间代谢产物(乳酸[2]、葡萄糖[3]、氨基酸[4]等)、异生物(农药[5]、毒素[6]、化学战剂、生物战剂[7]等)、病原体(寄生虫[8]、细菌[9]、病毒[10]等),在军事医学领域具有明显的研究前景。

1 电化学生物传感器检测原理

电化学生物传感器以电极作为固定载体和信号转换器,将生物体或生物大分子等敏感元件固定在电极上。通过电化学分析方法[11],传感器利用检测底物与电极上生物敏感元件之间的特异性识别作用,将反应过程中物质之间相互作用产生的生物学信号通过电极转化成可定量检测的电信号,底物浓度与电信号的检测值在一定范围内成正相关关系,因此能够实现对底物浓度的定性定量检测。

在电化学传感器中,所用的电极系统通常为两电极或者三电极传感平台,具体由参比电极和工作电极构成。其中,参比电极用于提供稳定和可重复的电压,通常放置在工作电极的相对固定位置。通过比较参比电极和工作电极的电压,帮助测量物质浓度。工作电极通常为传感器中的信号转换器,有关反应的电子转移常常会在其表面发生,可形成可靠的电流回路。

2 电化学生物传感器的分类

电化学传感器主要分为电位型传感器和电流型传感器[12],其主要区别在于工作方式的不同。电位型生物传感器是指待测物质和生物敏感元件反应产生的生物信号经信号转换器后能够输出为电压信号的生物传感器,而电流型生物传感器则是待测物质和生物敏感元件反应产生的生物信号经信号转换器后能够输出为电流信号[13]。

电化学生物传感器可以根据其具体所采用的信号转换器(电极、场效应晶体管、光纤及荧光剂、热敏电阻等)、生物敏感元件(酶、微生物、抗原或抗体、脱氧核糖核酸、动植物组织、细胞器等)进行分类。本文将主要根据生物敏感元件的不同,具体介绍酶电极传感器、微生物电极传感器、电化学免疫传感器、电化学DNA传感器、组织电极传感器、细胞器电极传感器这6种电化学生物传感器[14]。

2.1酶电极传感器酶电极传感器的敏感元件为生物酶[2],信号转换元件为电极。其主要检测原理是酶的催化作用将难以用于电化学检测的底物催化反应为易于检测的产物。鉴于酶的高度专一性和高效催化作用,被测底物的浓度能够与反应产生的电信号在一定条件下呈现出线性关系,酶电极传感器将酶作为敏感元件可以高效检测物质浓度。此外,酶电极传感器还可以检测辅助因子、酶活性调节因子和抑制剂等小分子,其主要原理是基质存在时,这些小物质会影响传感器的输出信号。

2.2微生物电极传感器微生物电极传感器[15]的敏感材料为微生物(常为细菌和酵母菌),通过生物、化学或物理方式,直接把活的微生物作为分子识别元件固定在电极表面。其工作原理大致可分为以下3种类型:①利用微生物对有机物的同化作用,通过检测其随呼吸活性(耗氧量)的提高氧浓度的减少量间接测定有机物的浓度;②微生物在生存过程中反应产生的代谢产物也可作为检测物质,通过测定对电极敏感的一些代谢产物可以间接测定部分能被厌氧微生物同化的有机物;③利用微生物体内含有的酶来识别分子,根据其酶促反应的快慢检测底物浓度。

2.3电化学免疫传感器电化学免疫传感器是敏感元件为抗原或抗体等免疫物质的电化学生物传感器[16]。它不仅采用了电化学传感技术,还结合了免疫分析方法,将二者的优势相结合,既保留了电化学分析方法的高灵敏度,又兼具免疫分析方法的高选择性、专一性和可靠性。抗体对底物的强特异性使免疫分析一般不需要处理样品,同时可以还省略预分离的过程。电化学免疫传感器在生化检测领域是十分重要的发明之一。此外,电化学免疫传感器还可以根据测定标记物的需求与否可分为直接电化学免疫传感器与间接电化学免疫传感器。

2.4电化学DNA传感器电化学DNA传感器将基因探针或单链DNA(single stranded DNA,ssDNA)作为敏感元件固定在电极表面[16],同时结合可以识别杂交分子的电活性指示剂(杂交指示剂),最终检测特定基因。电化学DNA传感器具有不同于其他电化学传感器的工作模式,它首先利用特异识别作用(分子杂交),使固定在电极表面的某一特定序列的ssDNA与溶液中的互补序列相结合,产生双链DNA(double stranded DNA,dsDNA),从而改变电极表面性质,再通过杂交指示剂特异性识别ssDNA和dsDNA产生有关电流信号的改变检测基因。

2.5组织电极传感器组织电极传感器利用的敏感元件通常为动植物的组织薄片,利用动植物组织中的生物酶传导电子信号,相较于酶电极传感器中的离析酶而言,优点是传感器元件制备简单,材料容易获取,组织中酶活性及其稳定性,传感器使用寿命长等,但在反应的响应时间、选择性、灵敏度等方面还有待改进[17]。

组织电极传感器常用的植物组织有:根、茎、叶、花、果等,动物组织有:肾、肠、肝、胸腺、肌肉等组织。植物组织电极比动物组织成本更低、制备更为方便,并且易于保存。

2.6细胞器电极传感器细胞器电极传感器的敏感元件为生物体内各种细胞器,包括但不限于溶酶体、叶绿体、线粒体、微粒体、过氧化氢体、磁粒体、氢化酶颗粒等[18]。其主要工作原理是借助细胞器内的酶,通过酶促反应的快慢来间接检测底物浓度的变化。

3 电化学生物传感器在军事医学中的应用

在军事医学领域中,方便且高效的传感器向来是研究热点。与其他医用传感器相比,用于军事医学的传感器使用场景特殊——环境复杂、条件恶劣、运动频繁等,因此与临床使用的传感器相比,高可靠性、高抗干扰性、低使用条件性、非接触性一直是军事医学传感器研究者所追求的目标。而电化学生物传感器以其专一性强、灵敏度高、响应快等优点在军事医学领域有着较为广泛的应用前景。

在军事医学领域中,电化学生物传感器主要用于检测生物战剂、化学战剂和监测生理特征等野外作战环境当中。相较于临床使用的传感器,其要求检测更加迅速敏捷、特异性更强,同时针对恶劣复杂的作战环境,要求传感器体积小、易于携带。

3.1检测生物战剂微量的生物战剂就能够在很短时间内造成大量的人员伤亡。在生物战剂中,使用最多的便是具有传染性的病原体以及生物毒素。因此,在生物恐怖袭击中早期准确识别生物战剂并采取有效的防御治疗策略十分必要。电化学生物传感器具有灵活、简单、便携、快速、特异性强、敏感性高等优点,被广泛用于检测及实时诊断分析工具的研发,可以检测多种病原体(金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、沙门菌、致病性气单胞菌、粪肠球菌、布鲁氏菌等[19]),将在生物战剂检测中发挥重要作用,是实现战现场实时检测和满足军队应急需要的理想装备[20]。

从最初的酶电极传感器发展至今日的光寻址电位传感器(light addressable potentiometric sensor, LAPS),电化学生物传感器一直沿着轻量化、一体化、简便化、快速化的道路发展。此外,对病毒、细菌这类病原体具有高度特异性和核酸探针功能的抗体光纤生物传感器与核酸探针生物传感器也备受关注。

目前,美国军队(简称“美军”)已经研制出一款环境传感器,其可佩戴在士兵作战服上提醒士兵环境状况,避免士兵遭受中暑、肠道传染等疾病。此外,美军所研发的创伤生命支持/运输系统,同样可以监测生物战剂及环境状况,并且能够及时调节系统内部空气,隔离外部环境,以保证伤员的生命安全。美军研制的各类各范围生物战剂探测仪,大部分均采用多路生物传感器,并配有化生战剂图示及辅助决策系统。据报道,美军在2000年时已研制出可检测葡萄球菌肠毒素B、蓖麻素、肉毒杆菌和土拉弗氏菌等4种生物战剂的免疫传感器,检测时间为3～l0 min,灵敏度分别为10 mg/L、50 mg/L、5×104CFU/mL和5×105CFU/mL。Song等制成了用于霍乱病毒检测的生物传感器。其可在30 min内检测出低于1×10-5mol/L的霍乱弧菌,并有较高的敏感性和较好的选择性,操作简便。此方法可应用于具有多个信号识别位点的蛋白质毒素和病原体的检测。电化学DNA传感器通过与靶DNA分子杂交而定量检测靶DNA,具有相当高的选择性和灵敏度。电化学DNA传感器可以检测多样的微生物,包括分枝杆菌、梭状芽孢杆菌、奈瑟菌等[21]。

综上所述,电化学生物传感器技术是目前最常用的快速鉴定和检测生物战剂的方法[22]。

3.2检测化学战剂目前,在检测化学战剂领域研究和应用最多的是基于乙酰胆碱酯酶的电极生物传感器。20世纪50年代,就有酶检测方法用于检测沙林毒气,可检出0.1～0.5 ppm的沙林。目前,这一方法仍被广泛使用中,在多个军方设备例如报警器中都有其身影所在。美军制作的基于酶电极的生物传感器自侦报警器能够对所有化学战剂都能进行准确、快速检测;荷兰的警告报警系统、英国的那伊阿得报警探测器和我国的酶报警器的敏感元件都是神经性毒剂抑制胆碱酯酶[23]。Saito等[24]开发了自主空气采样和检测系统,可用于评估可能对人有害的化学和生物战剂。

目前,已有相关研究报道表明电化学生物传感器可以用于检测的化学战剂如下:沙林毒气、氯气、氨气、氢氟酸等。

3.3监测生理特征电化学生物传感器在军事医学中也可以用于快速诊断与早期诊断。电化学生物传感器可以被用来监测战场伤员的生命体征,如血氧饱和度、血糖水平等。这些数据可以帮助医务人员及时处理伤员的状况。一些有重要临床诊断意义的基质(如血糖﹑乳酸、谷氨酰胺等)都可用电化学生物传感器来检测。血药浓度的检测能指导临床治疗从经验性转向科学性。此项工作的开展可以减小药物的毒副作用,防止毒效发生。

目前在血液检测中广泛应用的是葡萄糖酶传感器。多个国家已经研发出了相关的葡萄糖酶传感器用来临床检测生理指标,在几分钟内,通过极少量的血液,便能得到可靠的结果。

乳酸监测对于诊断和评估与乳酸酸中毒相关的健康问题以及在缺氧情况下的健康问题至关重要。因此,患者的血乳酸水平可作为疾病严重程度的警报信号,也可用于改善广泛疾病的诊断和治疗。酶电极生物传感器常被应用于乳酸浓度在线检测[25]。

士兵的身心健康与疲劳程度息息相关,若是过度疲劳,则会对军事训练造成剧烈影响。随着军事训练的频率不断增加,及时、便携和准确地诊断疲劳对于避免疲劳诱发的事故至关重要。然而,传统的检测方法需要复杂的样本制备和血液采样过程,无法满足疲劳诊断的及时性和便携性。随着柔性材料和生物传感技术的快速发展,目前可穿戴式生物传感器越来越受到研究人员的重视。可穿戴生物传感器可从非侵入性生物液体(如汗液、唾液和泪液)中收集生物标志物,在生物传感模块的帮助下连续定量地进行生物传感,然后可以通过无线通信模块传输检测信号,实时了解异常状态。可穿戴生物传感器的最新发展目前集中在用于代谢物检测的小型化可穿戴电化学和光学生物传感器上[26]。

4 展 望

目前,电化学生物传感器的电极尺寸已然进入纳米水平,正逐步向微系统化与超微型化发展。此外,以LAPS为标志的多参数测量型电化学生物传感器成为另一大发展趋势。综合来看,应用于军事医学领域的电化学生物传感器主要朝着以下三个方面发展:①利用新型材料优化性能,提高户外使用的特异性与灵敏度,能够更加高速准确地检测生化战剂、病原体、生理标志物等;②通过局域网络,将电化学生物传感器与医疗监测系统相连接,实现远程实时监测与数据传输,提高救助成功率;③通过智能化系统,自动采集与管理数据,并利用人工智能进行数据处理,提出实时个性化治疗方案,根据战场伤者的生化指标,精准调节药物输送量,提高治疗效果。

电化学生物传感器以其高敏感性和特异性、设备便携易于小型化、操作简单及实时检测等优点,正成为军事医学传感器研制开发领域的热门研究对象。随着人们逐步深入了解感染性病原体,及新型分析技术与材料技术等技术的发展,以电化学生物传感为基本原理的生物化学战剂检测设备、人体生理指标检测设备将使军队应急装备更加丰富,满足现代战争的需求。