山羊基因编辑研究进展

贾宇，杜瑞麟，闫烁，张思雨，赵宇龙，高原，郭鹏飞，杨燕燕，宋永利，李喜和,4*

（1.内蒙古大学省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010070； 2.内蒙古大学生命科学学院蒙古高原动物遗传资源研究中心，内蒙古 呼和浩特 010070； 3.内蒙古自治区农牧业科学院畜牧研究所，内蒙古 呼和浩特 010000； 4.内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院，内蒙古 呼和浩特 011517）

山羊作为人类早期驯化的家畜之一，有多种分类方式。按照体高可分为大型种、中型种及小型种，按照生产用途可分为乳用型、绒用型、毛用型、皮用型、肉用型及普通山羊[1-2]。奶山羊是公认的重要乳用品种山羊，其奶源营养价值颇高，适合饮用，是现代乳品、乳制品等的重要原料之一。绒用型山羊、毛用型山羊和皮用型山羊这3 个品种羊的绒、毛及皮产量和质量较高，被人类广泛应用于服装制造、材料加工等行业。肉用型山羊如波尔山羊的肉用性能较高。然而，普通山羊各个方面的生产性能都较为单一，无突出优点，常被用作科研动物模型，如研究山羊某一基因的选择性表达等。

1 乳用型山羊基因敲除研究进展

乳脂中有98%是甘油三酯（triglyceride，TAG），其余由胆固醇和游离脂肪酸组成。TAG 中的单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）为人类提供能量，有抗心血管和抗炎作用。羊奶一直被认为是一种营养保健品，因为它的脂肪球更小，脂肪含量更高，且拥有比牛奶更低的致敏性。与牛奶相比，羊奶TAG中的中、短链脂肪酸（medium-chain fatty acid，MFA；short-chainfatty acid，SFA） 和不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）含量较高。

相比于牛奶，羊奶产量一直较低，而含有特定营养物质的转基因奶山羊的乳汁产量则更为稀缺。近年来，对山羊奶奶源的研究逐渐增多。贾启鹏等[3]通过基因编辑技术，利用成簇有规律间隔的短回文重复序列 （clustered regularly interspersed short palindromic repeats，CRISPR） 及其相关蛋白 9 （CRISPR -associated 9，Cas9） 和双载体转染法获得β-酪蛋白（β-casein，CSN2）基因敲除的细胞，为羊奶CSN2 基因敲除提供了核供体。该试验首次在奶山羊胎儿成纤维细胞上实现7 760 bp 基因长片段的敲除，筛选出了奶山羊胎儿成纤维细胞敲除系最高阳性细胞比例获得方案，从而优化了大片段阳性细胞制备技术。田慧彬[4]又利用CRISPR/Cas9 系统探究了硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1，SCD1）基因在乳腺脂肪酸代谢中的功能。结果表明，SCD1 对MUFA生物合成有重要影响，同时也调控着TAG 和胆固醇的合成。该研究成果为小鼠和奶山羊SCD1 基因敲除提供了技术支持。乙酰/丙二酸单酰基转移酶（acetyl-CoA and malonyl-CoA transacylases，MAT） 是脂肪酸合酶的一个功能域，反刍动物的MAT 功能域在脂肪酸合成过程中同时具有起始、延长与终止活性功能，在动物机体合成MFA、SFA 时起关键作用。姚玮玮[5]对敲除MAT 基因的乳腺上皮细胞模型进行脂代谢功能研究，发现大部分相关脂肪酸合成基因均显著下调。microRNA（miRNA）-24 在非反刍动物的脂肪组织和肝脏的脂质代谢中起着重要作用。为明确miRNA-24 在反刍动物奶山羊中的具体作用，Huang 等[6]在原代山羊乳腺上皮细胞（goat mammary epithelial cells，GMEC） 中鉴定了miRNA-24 在调节乳汁脂肪合成和分泌过程中的功能，发现miRNA-24 能够降低脂肪酸、TAG 和转录调节因子相关基因的基因丰度，miRNA-24 的敲除会抑制脂滴、TAG 和胆固醇合成并影响脂肪酸组成。该研究结果为miRNA-24 在山羊乳腺细胞脂质代谢中具有重要生物学作用提供了证据。以上研究为山羊乳腺细胞乳蛋白、乳脂合成代谢提供了重要生物学证据，并对改善羊奶脂肪酸含量奠定了基础。

此外，奶山羊的群体性别比例对生产性能和经济效益也有重要影响，因此通过转基因技术进行性别控制也是科研热点之一。Zfy 是控制哺乳动物性别的关键基因之一。黄敏等[7]将萨能奶山羊成纤维细胞Zfy 基因敲除进行研究，从而为奶山羊Zfy 基因的功能研究及性别控制技术的发展奠定了理论与技术基础。

2 绒用型山羊基因敲除研究进展

绒山羊是一种以产绒为主的绒肉兼用型优良山羊品种。绒山羊的产绒性能和质量与其经济效益密切相关，因此绒山羊的研究以其产绒性能为热点。第一个上皮性角蛋白辅助蛋白（KAP）的发现表明，KAP 家族基因与毛囊的生长发育存在紧密关系。此外在真皮乳头状细胞中，同源蛋白盒（Hox）转录因子的表达控制着毛囊生长的区域差异。2020 年，在CRISPR/Cas9的理论基础下，单基因编辑技术也随之诞生。同年，李冠纬[8]利用以上技术，通过第3 代单基因编辑器（BE3）对陕北白绒山羊的成纤维细胞生长因子5 （FGF5）基因进行敲除。已知FGF5 基因是毛发生长发育的关键因子，其存在可抑制陕北白绒山羊绒毛的生长。当FGF5 基因被敲除后，陕北白绒山羊绒毛生长速度明显加快，羊绒产量进一步提升。并且相关专家利用FGF5 基因在其他动物身上也开展了研究，FGF5 的错义突变与单峰骆驼毛长变化有关[9]。胆固醇修饰的siRNA 抑制FGF5 和FGF18 的表达，可促进小鼠的毛发生长，延边牛适应极端寒冷的气候也与FGF5 有关。Lei 等[10]鉴定了羊毛囊形成、表皮分化和毛囊干细胞发育相关的重要基因有PRX、SOX18、TGM3 和TCF3。He 等[11]通过基因网络分析又揭示了羊毛囊形态发育相关的关键基因如LAMA10、WNT25A、KRT1、SOSTDC21、ZDHHC1、FZD7、BMP4、LRP2、TGFβ79、TMEM10、SOX4、ITGB14、KRT6、ITGA2 和GLI 等。Yu等[12]研究了miR-27a 及其靶向基因PIK3R3 对AKT/MTOR 途径以及绵羊毛囊干细胞（HFSCS）增殖和凋亡的影响，发现PIK3R3 表达的敲低可显著抑制HFSCs的增殖并促进其凋亡，同样，miR-27a 模拟物显著抑制了HFSCs 的增殖并促进了细胞凋亡。

内蒙古绒山羊是中国优秀的地方品种，根据羊被毛的长度可分为3 种类型：长毛型（毛长＞22 cm）、短毛型（毛长≤13 cm）和中间型（13 cm＜毛长≤22 cm）。毛发长度也影响着羊绒经济价值，为探究不同毛型生长的分子机制及相关调控基因，Gong 等[13]对12 月龄内蒙古长毛型（LHG）和短毛型绒山羊（SHG）的基因表达数据和表型数据进行了研究，探索了不同毛型和其相关的9 个候选基因共表达模块。结果表明，加权基因共表达网络分析（WGCNA）将这些基因分为19 个共表达模块，其中1 个模块与不同毛发类型之间存在很强的相关性。该模块基因在LHG 中高表达，在SHG 中低表达； 对该模块基因进行GO 功能分析，结果主要富集在细胞成分；KEGG 通路主要富集精氨酸以及脯氨酸代谢 （chx04010） 和MAPK 信号通路（chx39）。与此同时，他们也筛选了不同毛型相关的候选基因，包括KRT74、KRT100861184、LOC102177231、LOC102178767、LOC102179881、LOC106503203、LOC108638293、LOC108638298 和LOC 等。通过qRTPCR 检测发现，2 种毛发类型之间的这些候选基因表达存在显著差异，且大多与毛长呈显著正相关。以上研究中大量与山羊皮、绒毛生长发育相关基因的发现都可作为改善皮、绒毛的理论研究基础，进一步研究后可应用于生产实践。

3 肉用型山羊基因敲除研究进展

目前，人类严重依赖牲畜来满足肉类、奶类等日常基本生活需求。肉质性状的控制、改良是畜牧业生产（包括猪、牛及羊等）的重要目标。因此，更好地了解肌肉发育及最终生长结果的生化特性是动物生产和肉类科学的主要挑战课题。有关肌肉的研究能使养殖者了解动物的肌肉生长特性，从而更好地管理猪、牛及羊等，最终提高肉用型动物的经济效益。为了在短期内迅速培育优良品种，对牲畜进行基因改造成为最好的策略之一。基因工程和转基因的优势可在短时间内显著提高牲畜生产性能，增加经济效益。肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）是动物体内天然产生的蛋白质，是一种众所周知的骨骼肌发育负调节因子，具有抑制动物肌肉生长的功能。1997 年，美国约翰霍普金斯大学的Mcpherron 博士首次发现MSTN 是影响肌肉生长的最主要的代谢限制因子[14]。MSTN 蛋白由MSTN 基因编码，位于2 号染色体2q32.2；它在3 个外显子中编码375 个氨基酸，占据大约8 kb 的位置。MSTN 基因编码区自然突变导致表达量减少，敲低或敲除MSTN 会导致肌肉量增加，这一发现被认为是研究提高肌肉量和发展肉用型家畜的重大成功。MSTN基因突变可导致猪、牛、羊和人类出现肌肉肥大或双肌（DM）表型，而MSTN 的过表达则与肌肉萎缩有关。Zhang 等[15]利用CRISPR/Cas9 和体细胞核移植相结合的方法构建了位点特异性敲入阿巴斯绒山羊模型，将FAT1 基因特异性插入山羊MSTN 位点，实现了FAT1插入与MSTN 同步突变。刘姣[16]在陕北白绒山羊实现了这2 个基因的同时编辑，并且发现MSTN 敲除后绒山羊的能量和蛋白质代谢相关通路被影响，从而促进了肌肉生长。同年，为了对比CRISPR/Cas9 和转录激 活 因 子 样 效 应 物 核 酸 酶 ［transcription activator-like （TAL ） effector nucleases，TALENs］这2 种基因编辑技术在大型动物中进行基因组编辑的差异, Zhang 等[17]通过构建绒山羊模型应用CRISPR/Cas9 和TALENs 技术在多个水平上敲除MSTN 基因。结果发现，CRISPR/Cas9 获得MSTN 的突变频率是TALENs 的8.5 倍。相比于TALENs 技术，CRISPR/Cas9 更精确、效率更高，具有显著优势。这可能也是CRISPR/Cas9 技术在生物技术领域成为首选的基因编辑技术，获得一致认可的原因之一。Kumar等[18]评估了MSTN 下调对山羊成肌细胞中MRF 基因家族（MyoD、Myf5）、follistatin（FST）和IGF（IGF-1 和IGF-2） 表达的影响。结果表明，MSTN 下调导致MyoD 表达上调，Myf5 和FST 表达下调。此外，在培养4 d 后，成肌细胞增殖增强了4 倍，证明了MSTN基因位点编辑可用于转基因山羊的生产培育，以增加肌肉质量、提高屠宰率并增加经济效益。CRISPR/Cas 介导的是一种包括间隔获取、crRNA （CRISPR RNA）生物发生/表达和靶标干扰3 个机制步骤在内的微生物免疫应答反应，位点特异性Cas9 生成的位点特异性双链断裂（DSB），在低等生物中能有效刺激同源重组 （homologous recombination，HR） 通路约10 000 倍，凭借此方法可以更好地提高粮食生产，如肉类的生产效率。

脂肪是肌肉的重要组成成分。在过去45 年中，由于动物遗传、营养和管理的进步及加工技术的变化，零售肉类的脂肪含量大幅下降。肉类和肉制品中总SFA 和反式脂肪酸 （TFA） 含量降低，并富集n-3 PUFA 浓度。饮食与人类非传染性疾病发病率存在关联，使人们对开发新型低致病的食物生产系统产生浓厚兴趣。与羊肉或牛肉相比，某些家禽的脂肪含量较低，多不饱和脂肪酸含量较高，TFA 浓度较低。改变羊肉、牛肉等的脂肪酸谱在很大程度上取决于摄入植物类型、微生物脂肪分解及瘤胃中膳食脂质的微生物氢化，这是单胃和反刍动物肉类脂质组成差异的主要原因之一。昼夜节律调节因子2 （period circadian protein2，PER2）是一种主要的生物钟基因，与各种非反刍动物的细胞增殖和脂质代谢密切相关。Gao 等[19]从断奶山羊中分离瘤胃上皮细胞（REC），用免疫荧光法测定细胞中时钟蛋白 （clock protein）CLOCK 和PER2 蛋白的丰度，使用短干扰RNA 敲除模型研究PER2 的作用，并使用丁酸钠评估上调PER2 的效果，以探究山羊REC 中生物钟相关的mRNA 丰度，并确定PER2 对细胞增殖和SCFA 转运体（脂代谢、细胞增殖和凋亡相关基因）mRNA 丰度的影响。结果表明，CLOCK 和PER2 可能在控制细胞增殖、SCFA 和脂质代谢中发挥作用，从而得以改变山羊的肉质。相关肉类的研究在农场动物身上还有很多，如通过CRISPR/Cas9 技术敲除MSTN 调控中华黄牛生长性状； 利用CRISPR-Cas9 系统编辑猪IGF-2 调控元件来改善猪的生长速度，在不影响其肉质的情况下以此改善猪的产肉量等。由此可见，基因编辑技术为提高畜牧业生产力和应对全球畜牧业生产可持续性提供了理论基础和可行方案。

4 山羊作为试验模型基因敲除研究进展

相比于牛、马等大型哺乳动物，山羊生长周期短、饲养成本更低、更易管理。因山羊对环境的适应性普遍较高、易饲养，所以经常被用来作为研究某一特定基因选择性表达的模型动物，参与科学技术的更新、互作及相关传染病的研究。

压力性尿失禁 （stress urinary incontinence，SUI）是女性人群中常见的健康问题，影响女性的生活质量，但目前还没有适合大部分患者的治疗方法。由于伦理问题限制，患SUI 的灵长类动物模型无法构建，这使得农场动物模型成为最佳选择。Amend 等[20]为研究SUI 的发病机制，通过CRISPR/Cas9 技术建立山羊病理模型，在规定的条件下诱导尿失禁，模拟已知的SUI 危险因素（如分娩或手术损伤等）后，发现与两足动物相比，四足动物的腹部肿块不会直接压迫盆底，膀胱的压力较小。此外，大型动物还可以使用标准仪器进行尿道手术。这为临床研究中改进手术器械或开发新型器械提供了参考依据。

同时，CRISPR/Cas9 和不同的技术结合极大地促进了家畜基因编辑的发展。Fan 等[21]详细地描述了使用CRISPR/Cas9 和体细胞核移植 （somatic cell nuclear transfer，SCNT）技术相结合的策略，即从构建山羊CRISPR/Cas9 靶向载体开始，到将克隆胚胎转移到雌性受体的试验过程。利用 CRISPR/cas9系统可构建稳定敲除不同基因的细胞系，张志飞等[22]利用CRISPR/Cas9 系统以普通山羊细胞为模型敲除色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)1，成功建立了TPH1 基因稳定敲除的山羊乳腺上皮细胞系。

山羊痘病毒（goat pox virus，GTPV）是山羊痘的病原体，在山羊中较为流行。GTPV 会引起发热、皮肤结节、呼吸道病变和淋巴结肿大等症状。在我国，主要的山羊痘疫苗毒株为AV41（GTPV-AV41），该疫苗株源于1959 年青海分离的GTPV-AV40 菌株。Zhu 等[23]考虑到GTPV-AV41 接种的安全性和毒副作用，采用同源重组和Cre（环化重组酶）/Loxp 系统，在不影响复制的前提下，删除非必需基因片段，构建了与GTPVAV41 毒力和免疫调节功能相似的减毒山羊痘病毒（GTPV-TK-ORF）。体内和体外试验结果均表明，GTPV-TK-ORF 比野生型GTPV-AV41 更安全，具有良好的免疫原性，可保护山羊免受GTPV-AV40 的毒力感染，减少其发病率和死亡率。

5 思考与展望

将高新生物技术应用于畜牧产业中，是中国畜牧业进步发展弯道超车的重要手段。随着越来越多技术手段的开发，畜牧业产值在地方农业产值比重稳步增加，成为中国国民畜牧经济的重要发展战略之一。基因编辑技术在畜牧业发展过程中的作用也越来越重要。随着基因编辑技术的快速发展，锌指核酸酶（ZFNs）、TALENs 和CRISPR/Cas9 系统已被应用于精确修饰生物体内的内源基因。目前，有研究者已经能从分子水平上开展试验设计，使对山羊的研究在基因敲除的助力下更是不断突破。山羊奶成分的改善、肉质的改良及山羊MSTN 基因的敲除改变肌肉生长速度等，都是目前山羊产业的研究热点。基因编辑技术适用性强，目前已经广泛应用于其他动物的研究，如牛的基因组工程研究包括抗病性、根除过敏原（如β-乳球蛋白敲除）、产物生成（如动物种系）、引入有价值的特征及其健康调控（如心血管等疾病的纠正）等；猪的营养学研究（肉质改善、性别决定）、转录组分析及品种改良等也在有序开展。此外，基因编辑技术在小鼠、斑马鱼、绵羊、兔子及猴子等动物中均有涉及。

基因编辑技术作为近些年大热的工程技术，对大、小型动物的个体层面、群体层面的研究都在不断深入，但目前也有其自身缺陷和未能“探测”的领域，所以基因编辑技术这项工程的开展仍道阻且长。相信在研究人员的共同努力下，这项工程将完美竣工。未来包括山羊在内的大、小型动物的未知基因位点、基因性能及其他经济、社会价值等都将更加明了，基因编辑技术在畜牧业、制造业及医疗行业等领域的地位将更加重要。