护肝布祖热颗粒定性与定量质量控制方法的研究

王百才,汪依格,米梓毓,梁裕婷,玛依热·纳麦提,卡吾萨尔·恰依马尔旦,杨建华,2,胡君萍*

1.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830054；2.新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐 830054

护肝布祖热颗粒是由菊苣根、菊苣子、芹菜根、芹菜子、小茴香、茴香根皮以及菟丝子7 味药材加工制成，具有补益肝胃、散气止痛、利胆利水的功效［1］，临床上用于治疗急慢性乙型肝炎、黄疸性肝炎、急慢性胆囊炎、胆管炎、急慢性胃炎及泌尿系统感染等疾病［2］。维吾尔医认为菊苣药性湿寒味苦，有清肝利胆、健胃消食、利尿消肿的作用；芹菜药性干热，能消除寒湿闭阻、消食健胃、消肿散气、消石止痛；小茴香药性干热，有祛散寒气、温肾暖胃、通水利湿、消肿止痛的作用；菟丝子药性干热，有通阻止痛的作用［3］。现代药理学研究表明，护肝布祖热颗粒能抑制活性氧的产生，抑制应激活化蛋白激酶活性而减轻小鼠免疫性肝损伤［4］；其通过抑制炎症和抑制肝细胞凋亡对酒精致小鼠急性肝损伤发挥保护作用［5］；并能够减轻CCl4所致大鼠肝细胞变性、坏死及肝组织损伤，逆转大鼠肝纤维化［6］。此外，护肝布祖热颗粒通过抗氧化应激、抑制组织细胞凋亡、降低血清中炎症因子的水平保护小鼠急性肾损伤等［7］。

作为维吾尔医保肝护肝经典制剂，护肝布祖热颗粒现行的质量标准较简单，部颁标准中记载有处方、制法、性状、鉴别（三氯化铁反应和荧光观察）、检查、功能与主治、用法与用量、规格、贮藏等项目［1］，缺少用现代色谱学方法对制剂中药材进行定性鉴别和有效成分含量测定的质量控制手段，难以有效保证制剂质量的稳定性和临床用药的安全性。因此，本研究分别建立了处方中各药材的薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）鉴别方法，并用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）对其特征成分秦皮乙素进行了含量测定，以提高护肝布祖热颗粒制剂质量，为加强药品质量控制和提高临床疗效提供技术支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A 型高效液相色谱仪、 230 V 光电二极管阵列紫外可见光检测器（SPD-M220A），均购自成都岛津仪器设备有限公司；AB135-S 电子分析天平（梅特勒-托利多测量技术有限公司）；KQ5200DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ZF-2 型三用紫外仪（上海市安亭电子仪器厂）；LDP-500A 型高速多功能摇摆粉碎机（浙江永康市红太阳机电有限公司）；T200Y 电子秤（常熟市双杰测试仪器厂）；N-1001 旋转蒸发仪（上海爱朗有限公司）；DKT-B 型电热套和SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，均购自郑州长城科工贸有限公司。

1.2 试药

菊苣根（批号JJZ-YP-191209）、菊苣子（批号JJZ-YP-200527）均购自新疆和田维吾尔药材市场；芹菜根（批号Z30131002）、芹菜子（批号Z30142203）均购自新疆麦迪森维药有限公司饮片厂；小茴香（批号XHX-YP-170803，新疆恩萨尔维吾尔医饮片有限公司）；茴香根皮（批号HXGP-YP-210115，新疆维吾尔医院）；菟丝子（批号910023，新疆本草堂有限公司）；护肝布祖热颗粒（批号200568，新疆维吾尔药业有限责任公司）；秦皮乙素对照品（批号1025A023，北京索莱宝科技有限公司）；金丝桃苷对照品（批号09012021，上海同田生物技术公司）；芹菜素（批号WG20190312，西安绿腾生物科技有限公司）；东莨菪素对照品（批号21022308，上海纯优科技生物有限公司）；硅胶G 板（批号20141012）、高效硅胶G 板（批号20151014）均购自青岛海洋化工厂分厂；薄层色谱用甲醇、二氯甲烷、石油醚、甲酸、冰乙酸、乙酸乙酯、正丁醇、三氯甲烷、三氯化铝、磷酸均为分析纯，购自天津市致远化学试剂有限公司；甲醇为色谱纯，购自费希尔控制设备国际有限公司；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 TLC 法鉴别护肝布祖热颗粒中的药材

2.1.1 菊苣根和菊苣子的鉴别

2.1.1.1 秦皮乙素对照品溶液的配制 精密称取秦皮乙素对照品1.0 mg，加甲醇溶解，制成每1 mL含秦皮乙素0.2 mg 的对照品溶液。

2.1.1.2 供试品溶液的配制 称取护肝布祖热颗粒12.0 g，加甲醇100 mL 超声提取30 min，过滤后浓缩至2 mL，即得护肝布祖热颗粒供试品溶液。

2.1.1.3 对照药材溶液和缺方阴性对照溶液的配制 按照护肝布祖热颗粒的处方比例，称取菊苣根2.0 g 和菊苣子4.0 g，加100 mL 甲醇超声提取30 min，过滤后浓缩至2 mL，即得对照药材溶液。按照该处方比例，称取芹菜根4.0 g、芹菜子2.0 g、小茴香2.0 g、茴香根皮4.0 g、菟丝子1.0 g，按照2.1.1.2 项下供试品溶液制备方法制备缺方阴性对照溶液。

2.1.1.4 TLC 色谱条件与结果 分别吸取缺方阴性对照溶液、秦皮乙素对照品溶液、供试品溶液和菊苣对照药材溶液各5 μL，点于硅胶G 板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸（10∶0.3∶0.3）为展开剂展开，取出晾干，置于紫外光灯下检视。供试品溶液色谱在与秦皮乙素对照品色谱相应的位置上显示相同的蓝色荧光斑点，Rf 值为0.42；对照药材色谱在与对照品色谱相应位置显示相同颜色荧光斑点；缺方阴性样品色谱在与对照品色谱相应位置无干扰，表明该方法专属性良好。结果见图1。

图1 菊苣根和菊苣子的TLC 图Fig.1 TLC chromatogram of Cichorium intybus radix and semen

2.1.2 小茴香和茴香根皮的鉴别

2.1.2.1 东莨菪素对照品溶液的配制 精密称取东莨菪素对照品1.0 mg，加乙酸乙酯溶解，制成每1 mL 含东莨菪素0.2 mg 的对照品溶液。

2.1.2.2 供试品溶液的配制 称取护肝布祖热颗粒12.0 g，加100 mL 水超声提取30 min，提取液过滤，加乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层浓缩至2 mL，即得护肝布祖热颗粒供试品溶液。

2.1.2.3 对照药材溶液和缺方阴性对照溶液的配制 按照护肝布祖热颗粒的处方比例，称取小茴香2.0 g、茴香根皮4.0 g，加100 mL 水超声提取30 min，过滤，加等量乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯层溶液并浓缩至2 mL，即得对照药材溶液。按照该处方比例，称取芹菜根4.0 g、芹菜子2.0 g、菟丝子1.0 g、菊苣根2.0 g、菊苣子4.0 g，按照2.1.2.2 项下供试品溶液制备方法制备缺方阴性对照溶液。

2.1.2.4 TLC 色谱条件与结果 分别吸取东莨菪素对照品溶液、小茴香对照药材溶液、缺方阴性对照溶液和供试品溶液各5 μL，点于高效硅胶G 板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶4）为展开剂展开，取出，晾干，置于紫外光灯下检视。供试品溶液色谱在与东莨菪素对照品色谱相应的位置上显示相同的蓝色荧光斑点，Rf 值为0.63；对照药材色谱在与对照品色谱相应位置显示相同颜色荧光斑点；缺方阴性样品色谱在与对照品色谱相应位置无干扰，表明该方法的专属性良好。结果见图2。

图2 小茴香和茴香根皮的TLC 图Fig.2 TLC chromatogram of Foeniculum vulgare cortex and fructus

2.1.3 芹菜根和芹菜子的鉴别

2.1.3.1 芹菜素对照品溶液的配制 精密称取芹菜素对照品1.0 mg，加甲醇溶解，制成每1 mL 含芹菜素0.2 mg 的对照品溶液。

2.1.3.2 供试品溶液的配制 称取护肝布祖热颗粒12.0 g，加甲醇100 mL 超声提取30 min，过滤浓缩至2 mL，即得护肝布祖热供试品溶液。

2.1.3.3 对照药材溶液和缺方阴性对照溶液的配制 按照护肝布祖热颗粒的处方比例，称取芹菜子2.0 g、芹菜根4.0 g，加100 mL 甲醇超声提取30 min，过滤，将滤液浓缩至2 mL，即得对照药材溶液。按照该处方比例，称取菟丝子1.0 g，小茴香2.0 g、茴香根皮4.0 g、菊苣根2.0 g、菊苣子4.0 g，按照2.1.3.2 项下供试品溶液制备方法制备缺方阴性对照溶液。

2.1.3.4 TLC 色谱条件与结果 分别吸取芹菜素对照品溶液、芹菜对照药材溶液、缺方阴性对照溶液和供试品溶液各5 μL，点于高效硅胶G 板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-乙酸（12∶10∶1）为展开剂展开，取出晾干，喷以30 g·L-1AlCl3乙醇溶液显色，置于紫外光灯下检视。供试品溶液色谱在与芹菜素对照品色谱相应的位置上显示相同的蓝色荧光斑点，Rf 值为0.50；对照药材色谱在与对照品色谱相应位置显示相同颜色荧光斑点；缺方阴性样品色谱在与对照品色谱相应位置无干扰，表明该方法的专属性良好。结果见图3。

图3 芹菜根和芹菜子的TLC 图Fig.3 TLC chromatogram of Apium graveolens radix and semen

2.1.4 菟丝子的TLC 鉴别

2.1.4.1 金丝桃苷对照品溶液的配制 精密称取金丝桃苷对照品1.0 mg，加甲醇溶解，制成每1 mL含金丝桃苷0.2 mg 的对照品溶液。

2.1.4.2 供试品溶液的配制 称取护肝布祖热颗粒12.0 g，加水100 mL 超声提取30 min，过滤浓缩至10 mL，加等量正丁醇萃取3 次，合并正丁醇层浓缩蒸干，加甲醇2 mL 溶解，即得护肝布祖热供试品溶液。

2.1.4.3 对照药材溶液和缺方阴性对照溶液的配制 称取菟丝子2.0 g，加水100 mL 超声提取30 min，过滤，浓缩至10 mL，用等量正丁醇萃取3 次，合并正丁醇层浓缩蒸干，加甲醇2 mL 溶解，即得对照药材溶液。按照护肝布祖热颗粒的处方比例，称取芹菜根4.0 g、芹菜子2.0 g、小茴香2.0 g、茴香根皮4.0 g、菊苣根2.0 g、菊苣子4.0 g，按照2.1.4.2 项下供试品溶液制备方法制备缺方阴性对照溶液。

2.1.4.4 TLC 色谱条件与结果 分别吸取金丝桃苷对照品溶液、菟丝子对照药材溶液、缺方阴性对照溶液和供试品溶液各5 μL，点于高效硅胶G 板上，以乙酸乙酯-丙酮-乙酸-水（5∶3∶1∶1）为展开剂展开，取出晾干，30 g·L-1AlCl3乙醇溶液显色，置于紫外光灯下检视。供试品溶液色谱在与金丝桃苷对照品色谱相应的位置上显示相同的蓝色荧光斑点，Rf 值为0.42；对照药材色谱在与对照品色谱相应位置显示相同颜色荧光斑点；缺方阴性样品色谱在与对照品色谱相应位置无干扰，表明该方法的专属性良好。结果见图4。

图4 菟丝子的TLC 图Fig.4 TLC chromatogram of Cuscuta chinensis semen

2.2 HPLC 法测定护肝布祖热颗粒中秦皮乙素的含量

2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取护肝布祖热颗粒12.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液50 mL，超声处理30 min，上清液过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.2 对照品溶液及缺方阴性对照溶液的配制 精密称取秦皮乙素对照品 5.0 mg，加甲醇定容于5 mL量瓶中，精密吸取0.2 mL 置于50 mL 量瓶中，并用甲醇稀释定容，过0.22 μm 微孔滤膜得到质量浓度为4 μg·mL-1的秦皮乙素对照品溶液。按照护肝布祖热颗粒处方比例，除去菊苣根和菊苣子，称取剩余各味药材芹菜根4.0 g、芹菜子2.0 g、小茴香2.0 g、茴香根皮4.0 g、菟丝子1.0 g，加入甲醇50 mL，超声30 min，提取液过0.22 μm 微孔滤膜，即得缺方阴性对照溶液。

2.2.3 色谱条件 色谱柱为SunFire C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温为30 ℃；流速为1 mL·min-1；进样体积为10 μL；检测波长为349 nm；流动相为甲醇（A）-1 mL·L-1磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～2 min，5% A；2～5 min，5%～27% A；5～30 min，27% A）。

2.2.4 系统适用性实验 分别取上述供试品溶液、秦皮乙素对照品溶液和缺方阴性溶液适量，按照2.2.3 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，秦皮乙素色谱峰峰形好，tR=15.8 min，且与邻近色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数不低于5 000，缺方阴性样品溶液对秦皮乙素的测定无干扰。色谱图见图5。

图5 各样品HPLC 色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of samples

2.2.5 线性关系考察 取2.2.2 项下秦皮乙素对照品溶液适量，分别取样0.2、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0 mL，用甲醇定容至5 mL 量瓶中，过0.22 μm 微孔滤膜，按照2.2.3 项下色谱条件进样，进样体积为10 μL，记录峰面积，以对照品质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y），计算回归方程为y=57 382x-2 594.3（r2=0.999 7）。结果显示，秦皮乙素质量浓度在0.16～4.00 μg·mL-1范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度考察 取2.2.2 项下秦皮乙素对照品溶液适量，按照2.2.3 项下色谱条件，于1 d 内连续进样6 次，进样体积为10 μL，记录峰面积，结果显示，秦皮乙素峰面积的RSD 值为0.19 %，表明仪器的日内精密度良好。

2.2.7 重复性实验 精密称取同一批次护肝布祖热颗粒（批号200568）6 份，各12.00 g，按照2.2.1 项下方法平行制备6 份供试品溶液，按照2.2.3 项下色谱条件进样，进样体积为10 μL，记录峰面积，代入线性回归方程计算秦皮乙素的含量及其RSD 值。结果显示，含量的RSD 值为1.43%，表明供试品溶液制备方法的重复性良好。

2.2.8 稳定性实验 精密称取护肝布祖热颗粒（批号200568）12.00 g，按照2.2.1 项下方法制备供试品溶液，按照2.2.3 项下色谱条件于0、2、4、8、12、24 h分别进样，进样体积为10 μL，记录峰面积。结果显示，秦皮乙素峰面积的 RSD 值为1.03%，表明供试品溶液在室温下24 h 内稳定性良好。

2.2.9 加样回收率实验 精密称取同一批次护肝布祖热颗粒（批号200568）9 份，各12.00 g，分别加入低、中、高质量浓度的秦皮乙素对照品溶液，按照2.2.1 项下方法制备供试品溶液。进样体积为10 μL，记录峰面积，计算加样回收率。加样回收率（%）=［（测得量-样品含量）/加入量］×100%。结果显示，秦皮乙素的平均加样回收率为97.71%，平均RSD 值为0.83%，表明该方法准确可靠。结果见表1。

表1 秦皮乙素的加样回收率结果Tab.1 Results of recovery of esculetin

2.2.10 护肝布祖热颗粒样品的含量测定 精密称取护肝布祖热颗粒（批号200568）6 份，各12.00 g，按照2.2.1 项下方法制备供试品溶液。按照2.2.3 项下色谱条件进样，记录秦皮乙素色谱峰面积，计算含量。结果见表2。

表2 护肝布祖热颗粒的含量测定结果Tab.2 The results of content determination of Hugan Buzure Granules

3 讨论

护肝布祖热颗粒是由菊苣根、菊苣子、芹菜根、芹菜子、小茴香、茴香根皮和菟丝子7 味药材经水煎提取制成的颗粒剂。该处方中存在同一植物不同药用部位的2 种药材配伍使用的情况，如菊苣根和菊苣子、芹菜根和芹菜子、小茴香和茴香根皮，这是民族药复方配伍中的特殊现象，具体机制尚不明确。在研究质量控制方法时，考虑到来源于同一植物不同药用部位的2 种药材含有相同的化学成分，因此制备对照药材溶液和缺方阴性对照药材溶液时分别将二者合并提取或一起剔除。

护肝布祖热颗粒适用于肝寒、胃痛、脾阻胁痛及关节骨痛、风湿病、泌尿系统疾病的治疗。方中菊苣根和菊苣子具有保肝、降血糖、调节血脂、抗菌、抗氧化和抗炎等药理作用，菊苣中具有保肝活性的特征成分主要为倍半萜类（如山莴苣素、山莴苣苦素）和香豆素类（如秦皮乙素、秦皮甲素）等［8-10］；小茴香具有调节胃肠功能、镇痛、抗炎、抗肝肾毒性、降血脂、降血糖、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用，其主要成分为挥发油类（如反式茴香脑、茴香醛、茴香醚等）［11-12］；芹菜根和芹菜子具有抗肿瘤、降低血清尿酸、抗炎、抗痉挛、抗细菌感染、治疗皮肤疾病、抗肿瘤侵袭和转移、保护肝功能、预防骨质疏松等作用，其主要成分为芹菜素、肉桂醛、柚皮素等［13-16］；菟丝子具有降血糖、抗衰老、抗骨质疏松等作用，其成分主要为黄酮类化合物如金丝桃苷、山柰酚、槲皮素等［17］。上述这些成分均可以考虑作为质量控制的指标性成分，但在实验过程中发现有些成分用TLC 法检测不能得到很好的分离，专属性较差，如山柰酚、槲皮素、茴香醛等；而有些成分未检出，如小茴香中的特征性成分反式茴香脑，这可能与护肝布祖热颗粒组方复杂、用煎煮法提取后发生了化学成分的变化或挥发性成分的损失有关［18-20］。

定性鉴别的目的是分析制剂中各单味药材的真伪和存在与否，常用的方法有显微鉴别、一般理化鉴别、光谱鉴别等，其中薄层鉴别具有分离和鉴定的双重作用，特别适合中药组分复杂的情况，是中药鉴别的首选方法，本文探索了用秦皮乙素、东莨菪素、芹菜素、金丝桃苷4 个成分定性鉴别护肝布祖热颗粒中的各药材，填补了原标准中TLC 鉴别项的空白。HPLC 是中药复方定量分析的常用方法，具有分离效果好、检测灵敏等特点，本文建立了方中秦皮乙素HPLC 含量测定方法，虽然复方制剂单一成分定量不能客观反映其整体疗效，但结合TLC 定性鉴别能初步控制制剂质量。本研究对完善和提高护肝布祖热颗粒质量标准、提高该制剂质量控制手段和临床疗效做了有益尝试，今后还需要对多组分含量测定方法进行深入研究。