复方磺胺甲噁唑人体药动学与生物等效性研究

张 婷,李梦瑶,姜雅琦,田 杰,郭东生,甘方良

(1.湖北科技学院医学部药学院,湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院附属第一医院临床药理机构办公室)

复方磺胺甲噁唑为磺胺甲噁唑与甲氧苄啶组成的复方制剂,是一种磺胺类抗菌药物。磺胺甲噁唑(SMZ)通过竞争对氨基苯甲酸而抑制二氢叶酸的合成,甲氧苄啶通过与二氢叶酸还原酶结合,可逆性的抑制二氢叶酸还原为四氢叶酸。因此,磺胺甲噁唑和甲氧苄啶阻断了细菌所必需的核酸和蛋白质生物合成的两个连续步骤[1]。该药主要用于急性泌尿道感染、尿路感染、呼吸道感染、皮肤化脓性感染、扁桃体炎,肺炎链球菌或流感嗜血杆菌所致的2岁以上小儿急性中耳炎,成人慢性支气管炎急性发作以及志贺氏菌病。根据国家《关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》[2],本研究以寿光富康制药有限公司研制的复方磺胺甲噁唑片和Frontida BioPharm Inc.的原研对照药(BACTRIM®)进行人体生物等效性研究,以表明本品与原研药品的疗效和质量一致,从而为该药的上市临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品

复方磺胺甲噁唑片受试制剂T(寿光富康制药有限公司,规格:磺胺甲噁唑0.4g/甲氧苄啶80mg,批号:15021004);复方磺胺甲噁唑片参比制剂R(Frontida BioPharm Inc.公司,规格:磺胺甲噁唑0.4g/甲氧苄啶80mg,批号:7005301)。

1.1.2 仪器

UPLC I-Class液相色谱仪(美国Waters);Xevo TQ-S质谱仪(美国Waters);数据采集:UNIFI 数据处理软件(美国Waters);XPE105电子天秤(瑞士METTLER TOLEDO);ST16、ST16R离心机(美国Thermo Fisher);ULTS1368医用低温保存箱(美国Thermo Fisher)。

1.2 实验方法

1.2.1 试验对象及设计

空腹试验筛选66例受试者,入组24例健康志愿者,其中男18例,女6例;平均BMI为(22±2)kg/m2。所有受试者均通过体格检查,并自愿签署知情同意书。试验方案经咸宁市中心医院伦理委员会批准(批件号:咸医伦字-Y【2021】008号)。本试验采用单中心、随机、开放、单剂量、两制剂、两周期、两序列交叉设计,为空腹给药人体生物等效性研究,洗脱期为7d。

1.2.2 给药方法与血样采集时间点设计

给药当天受试者按随机方案单次口服磺胺甲噁唑0.4g/甲氧苄啶80mg T制剂或R制剂。240mL常温水送服,给药前及给药后1h内禁止饮水。在给药前(0h)以及给药后10、20、30、45min和1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、8、12、24、36、48h分别采集静脉血约4mL;测量给药前(0h)及给药后1、6、12、24、48h生命体征,试验全程记录不良事件。第2周期受试者重复第一周期过程,按随机方案分别服用另一种制剂。

1.2.3 血浆样本处理

①空白血浆样品:取空白血浆50μL至96孔聚丙烯板,加入250μL乙腈,将板密封后在振荡器上振荡2min,4000rpm,离心15min。取上清液30μL转移到另一个96孔聚丙烯板,加入1000μL稀释剂混匀,将样品转移至进样器中等待进样。②标准血浆样品:取标准血浆样品50μL转移到96孔聚丙烯板,加入250μL内标工作液YYMMDD-MIX-IS,将板密封后在振荡器上振荡2min,4000rpm,离心15min。取上清液30μL转移到另一个96孔聚丙烯板,加入1000μL稀释剂混匀,将样品转移至进样器中等待进样。③零浓度血浆样品:取空白血浆50μL至96孔聚丙烯板,加入250μL内标工作液YYMMDD-MIX-IS,将板密封后在振荡器上振荡2min,4000rpm,,离心15min。取上清30μL转移到另一个96孔聚丙烯板,加入1000μL稀释剂混匀,将样品转移至进样器中等待进样。

1.2.4 色谱条件和质谱条件

①色谱条件:色谱柱,Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm(2.1×50mm);流动相A:2mL乙酸铵水溶液;流动相B:乙腈;梯度走样,0～0.6min流动相A∶B=85%∶15%;1.2～1.6min流动相A∶B=10%∶90%;2.0min流动相A∶B=85%∶15%;流速:0.35mL/min;柱温:40℃;进样量:1μL。②质谱条件:电喷雾离子源(ESI);正离子模式;离子源温度:150℃;用于定量分析的离子反应分别为:磺胺甲噁唑(SMX):SMXm/z 254.10→108.04;内标磺胺甲噁唑-d4(SMX-d4):m/z 258.06→112.15;甲氧苄啶(TMP):m/z 291.14→230.05;内标甲氧苄啶-d3(TMP-d3)m/z 294.19→230.04;碰撞能量:SMX 18.0 V,SMX-d4 24.0 V,TMP 22.0 V,TMP-d3 22.0 V。

1.2.5 标准曲线和最低定量限(LLOQ)

以待测物与内标的响应比值(Y)为纵坐标,以系列标准血浆样品浓度(X)为横坐标,以加权(1/x2)最小二乘法回归运算得磺胺甲噁唑标准曲线为Y=0.144X+0.00268,r2=0.999143;甲氧苄啶标准曲线为Y=6.77X+0.00881,r2=0.999216。其中磺胺甲噁唑的LLOQ为0.250μg/mL,线性范围在0.250～50.000μg/mL;甲氧苄啶的LLOQ为0.010μg/mL,线性范围在0.010～2.000μg/mL。

1.2.6 选择性与特异性

使用6个不同来源的正常空白血浆,1个来源的高脂空白血浆和1个来源的溶血空白血浆制备空白血浆样品及使用6个不同来源的正常空白血浆配制的定量下限血浆样品考察选择性。每种样品平行1份。其典型SRM色谱图见图1,结果磺胺甲噁唑、甲氧苄啶和内标磺胺甲噁唑-d4、甲氧苄啶-d3的保留时间分别为0.99、1.32、0.98和1.31min。结果符合接受标准,表明本方法测试人血浆中磺胺甲噁唑和甲氧苄啶具有良好的选择性,人空白血浆、高脂血浆和溶血血浆对测试无干扰[3-4]。

A.空白血浆样品;B.最低定量下限样品;C.零浓度样品。

1.2.7 精密度、准确度和回收率

考察浓度为LLOQ、LQC、LMQC、HMQC、HQC(磺胺甲噁唑0.250、0.750、6.250、18.750、37.500μg/mL和甲氧苄啶0.010、0.030、0.250、0.750、1.500μg/mL)的质控标准血浆样品各6份,按1.2.3中②所述方法处理,进样10μL到色谱/质谱系统分析,代入相应线性回归方程计算各样品浓度测定值,据此计算各个浓度水平的批内和批间准确度与精密度。按回归方程计算实测浓度和提取回收率。结果见表1,符合接受标准,定量下限测得浓度的均值在标示值的80%～120%,其它质控浓度标准血浆样品测得浓度的均值在标示值的85%～115%;批内批间变异系数均小于15%,表明质控标准血浆样品的批内和批间的精密度和准确度良好。

表1 血浆样品批内、批间精密度和准确度测定

1.2.8 样品稳定性

按照1.2.3中②所述方法配置磺胺甲噁唑和甲氧苄啶低、高浓度质控样品,考察血浆样品分别在室温下放置0、26、46h,在4℃放置39d,10℃放置48h,-20℃放置30d,-70℃冻融4次的稳定性,测得浓度值的变异系数均小于15%,表明稳定性良好。

1.2.9 基质效应

采用8个来源的空白血浆(6个不同来源的正常空白血浆、1个来源的溶血空白血浆、1个来源的高脂空白血浆)不加内标进行处理以获取空白血浆上清液。取质控工作溶液(SLQC、SHQC)分别用8个来源的空白血浆上清液配制样品。磺胺甲噁唑浓度为LQC时,经内标归一化的基质因子的变异系数为6.39%;磺胺甲噁唑浓度为HQC时,经内标归一化的基质因子的变异系数为8.21%。甲氧苄啶浓度为LQC时,经内标归一化的基质因子的变异系数为6.49%,甲氧苄啶浓度为HQC时,经内标归一化的基质因子的变异系数为8.23%,表明无明显正常空白血浆、溶血空白血浆、高脂空白血浆基质效应,不影响定量分析。

1.2.10 安全性评价方法

基于安全集,按实际给药情况进行安全性分析。对以下内容进行临床安全性评估:①任何自发报告的和所有直接观察到的不良事件、严重不良事件;②生命体征任何有临床意义的改变(参考值范围90mmHg≤收缩压<140mmHg,60mmHg≤舒张压<90mmHg,60次/分≤脉搏(静息)≤100次/分;以研究医生判断为准);③试验期间体格检查、实验室检查、心电图检查等有意义的临床改变(以研究医生判断为准)。

1.3 统计学方法

根据受试者的个体血药浓度-实际采血结束时间点数据,采用Phoenix WinNonlin 8.2(Pharsight Corporation,Sunnyvale,CA)软件,以非房室模型法(NCA模块)对磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的药动学参数(Cmax、AUC0-t和AUC0-∞)等进行计算。

2 结 果

2.1 血药浓度-时间曲线和药动学参数

受试者单次口服T制剂和R制剂的血药浓度-时间曲线见图2。口服给药后1～4h各成分的血药浓度达到峰值,平均血清半衰期分别为10h和8～10h。药动学参数计算结果见表2。磺胺甲噁唑T制剂和R制剂的Cmax分别为(27.340±3.400)和(28.042±3.527)μg/mL;甲氧苄啶T制剂和R制剂的Cmax分别为(0.845±0.198)μg/mL和(0.838±0.144)μg/mL(P均>0.05)。

表2 空腹受试者和餐后受试者体内磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的主要药动学参数

图2 健康受试者空腹口服受试制剂T和参比制剂R

2.2 生物等效性评价

本试验中,针对磺胺甲噁唑,受试制剂与参比制剂Cmax、AUC0-t和AUC0-∞药动学参数最小二乘几何均值比的90%置信区间分别为94.41%～100.19%、98.70%～102.46%和98.52%～102.41%;针对甲氧苄啶,受试制剂与参比制剂Cmax、AUC0-t和AUC0-∞药动学参数最小二乘几何均值比的90%置信区间分别为92.69%～108.36%、100.97%～106.91%和100.86%～106.48%;均落在80.00%～125.00%判定范围内,表明空腹条件下,两制剂在吸收速度和吸收程度上均生物等效。结果见表3。

表3 受试者口服受试制剂T和参比制剂R生物等效性分析

2.3 安全性评价

本试验整个过程中两组均无严重或导致脱落的不良事件,安全性良好。受试制剂组:在进入PKPS的24例受试者中,最终完成两周期试验有23例。在服药的23例受试者中,4例受试者共发生10例次不良事件,转归为5例次无改变、4例次痊愈和1例次未知,不良事件发生率为17.4%,不良事件严重程度均为1级。参比制剂组:在服药的24例受试者中,5例受试者共发生8例次不良事件,转归为3例次缓解和5例次痊愈,不良事件发生率为20.8%。2例次不良事件严重程度为2级,其余6例次不良事件严重程度均为1级。

3 讨 论

本试验研究设计计算得空腹正式试验所需的最终受试者例数为20例。另考虑约20%的脱落率,空腹正式试验所需的最终受试者例数确定24例。本试验受试制剂和参比制剂中SMX和TMP几何均值比的90%CI均落在80.00%～125.00%,表明复方磺胺甲噁唑片受试制剂和参比制剂具有生物等效性。

SMZ和TMP在口服给药后1～4h各成分的血药浓度达到峰值,本试验0～4h内共采血11次,平均血清半衰期分别为10h和8～10h,给药24h后血液中可检出SMZ和TMP,给药3d后达到稳态状态,SMZ和TMP均为CYP3A4的底物,根据人体生物等效性指导原则,考虑代谢酶的影响,在保证药物代谢完全的基础下,清洗期选取7d。

本试验受试制剂组和参比制剂组不良反应发生率分别为4.3%、8.3%,1例不良反应严重程度为2级,其余均为1级。据文献报道[5-7],SMZ和TMP在体内代谢受诸多因素的影响,例如机体因素、肝功能障碍、饮食因素、遗传因素等,不良反应较多,变异较大。本次试验中SMX和TMP的AUC个体间变异最大值分别为3.81%和5.35%。对于长期用药的病人其代谢产物排泄较慢,已经超过体内药物积蓄,为了减少不良事件的发生,建议临床用药时加强药物监测,注意用药的合理性与安全性[8]。