金刚藤多糖的微波辅助提取及体外抗氧化、降血糖活性分析*

汪文丽,曲晓营,朱晓明,刘小玲

(1.湖北科技学院医学部药学院,湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院核技术与化学生物学院;3.辐射化学与功能材料湖北省重点实验室)

金刚藤,别名菝葜,广泛分布于陕西、湖北、四川等多个省份。多糖是其主要成分之一,被证实具有抗氧化、抗炎等作用,目前,主要以热水提取法进行提取,该方法具有简单、安全等优点,但也存在提取率低,耗时长的缺点[1-2]。微波辅助提取法可以加速植物细胞的破裂,更有利于成分的溶出。微波辅助提取法已广泛应用于皂苷[3]、酚类[4]等多种天然小分子物质的提取,也应用于多糖等大分子物质的提取[5-6]。有学者[7-8]证实微波法提取的木棉花多糖和喜树多糖具有较强的抗氧化、抑菌、抗肿瘤、免疫调节等活性。我们对金刚藤多糖的微波辅助提取工艺进行优化,分析其结构和体外抗氧化、降血糖活性,并与传统的热水法进行对比,以促进金刚藤多糖提取工艺技术的进步。

1 材料与方法

1.1 试验原料、试剂及仪器

切片状金刚藤(湖北咸宁);2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、抗坏血酸、α-葡萄糖苷酶(33U/mg)、阿卡波糖(含量≥98%)、PANG(阿拉丁试剂有限公司);DNS(索莱宝科技有限公司);无水乙醇、三氯乙酸、硫酸、苯酚、葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司);溴化钾(阿拉丁试剂有限公司);刚果红(永华化学股份有限公司)。

KWF-300分级超细连续式粉碎机粉碎(温州顶历医疗器械有限公司);MKJ-J1-8型微波实验炉(青岛迈可威微波应用技术有限公司);DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器、RF-2000A旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限责任公司);TDL-5A台式低速离心机(常州峥嵘仪器有限公司);UV-1901型紫外可见分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司);Specrtum Two FT-IR光谱仪(英国PerkinElmer公司)。

1.2 方法

1.2.1 金刚藤药材的预处理

将切片状的金刚藤于50℃烘干,约48h,粉碎,过80目筛,得到金刚藤原粉。将80%乙醇(mL)和金刚藤原粉(g)按照5∶1的比例混合,80℃回流3h,过滤,将滤渣用80%的乙醇洗涤3遍,50℃烘干,得到脱除脂类、色素和小分子物质的金刚藤,简称脱脂金刚藤。

1.2.2 金刚藤多糖的热水提取方法

(1)粗多糖的提取。称取一定量的脱脂金刚藤,按水料比12∶1(mL/g)混合,80℃热水提取2h。3800r/min离心10min,取上清液,50℃旋转蒸发,浓缩,加入4倍体积的无水乙醇,4℃静置12h。3800r/min离心5min,沉淀部分于50℃烘干,即为粗多糖。按公式①计算粗多糖得率。

①

(2)粗多糖除蛋白。取一定量的粗多糖用蒸馏水溶解,与5%的三氯乙酸等体积混合,振荡,于4℃冰箱中静置14h。3800r/min离心5min,取上清液,同1.2.2(1)的方法浓缩、醇沉、烘干,得除蛋白的多糖,即热水提取的金刚藤多糖(SCP-W)。

1.2.3 金刚藤多糖的微波辅助提取方法

称取一定量的脱脂金刚藤,按实验设定的微波功率、水料比、时间和温度提取粗多糖。同1.2.2(1)中公式的方法计算粗多糖得率,同1.2.2(2)的方法除蛋白,得微波辅助提取的金刚藤多糖(SCP-M)。

1.2.4 单因素试验

(1)水料比对粗多糖及多糖得率的影响。按不同的水料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL/g)加入原料,设置温度80℃,微波功率480W,提取时间18min,计算金刚藤粗多糖及多糖得率。

(2)微波功率对粗多糖及多糖得率的影响。按水料比30∶1(mL/g)加入原料,设置温度80℃,不同的微波功率(320、440、560、680、800W),提取时间18min,计算金刚藤粗多糖及多糖得率。

(3)温度对粗多糖及多糖得率的影响。按水料比30∶1(mL/g)加入原料,设置不同的温度(60、70、80、90、100℃),微波功率440W,提取时间18min,计算金刚藤粗多糖及多糖得率。

(4)时间对粗多糖及多糖得率的影响。按水料比30∶1(mL/g)加入原料,设置温度80℃、微波功率440W,不同的提取时间(9、18、27、36、45min),计算金刚藤粗多糖及多糖得率。

1.2.5 正交试验

根据单因素试验结果,以微波功率(W)、水料比(mL/g)、温度(℃)和时间(min)为研究对象,以金刚藤粗多糖和多糖得率为评价指标,设计四因素三水平正交试验,确定金刚藤粗多糖及多糖的最佳提取条件。

1.2.6 微波、热水提取多糖的含量测定

分别称取等量热水和微波提取的粗多糖,加蒸馏水溶解,配成0.5mg/mL的溶液,去除不溶物质。取100μL,加蒸馏水至1mL,加入6%苯酚0.5mL、浓硫酸2.5mL,在485nm处测定吸光度值,按公式②计算单位重量粗多糖提取物中的总糖含量。参考余丽梅等[9]的方法测定还原糖含量。根据公式③测定多糖得率。

②

多糖得率(%)=CP×(TS-RS)

③

式②中:c表示根据吸光度值计算的溶液质量浓度,mg/mL;D表示溶液稀释倍数;V表示样品溶液体积,mL;m表示粗多糖取样量,mg。

式③中:CP表示粗多糖得率(%);TS表示总糖含量(%);RS表示还原糖含量(%)。

1.3 结构分析

1.3.1 傅里叶红外光谱表征

分别取少量热水和微波提取的金刚藤多糖,按照与溴化钾1∶100(g/g)的比例混合,研磨、压片,在4000cm-1～400cm-1进行红外光谱扫描分析。

1.3.2 三螺旋结构表征

分别取热水和微波提取的金刚藤多糖,配成1mg/mL的溶液,测定混合溶液随NaOH溶液浓度的增加,样品最大吸收波长的变化[10]。

1.4 体外抗氧化活性试验

1.4.1 DPPH自由基清除实验

分别取热水和微波提取的金刚藤多糖,配成0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL的溶液,参考Hu等[8]的方法,测定样品溶液对DPPH自由基的清除率。

1.4.2 ABTS自由基清除实验

同1.4.1的方法配制金刚藤多糖溶液,参考胡玲玲等[11]的方法,测定样品溶液对ABTS自由基的清除率。

1.5 体外降血糖活性试验

同1.4.1的方法配制金刚藤多糖溶液,参考王春霞[12]的方法,测定样品溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.6 统计学方法

各组试验均重复3次,通过Origin 2021软件绘制红外光谱图,通过WPS Office表格绘制折线图并分析数据,结果以(均数±标准差)表示。

2 结 果

2.1 单因素试验

2.1.1 微波功率对金刚藤粗多糖及多糖得率的影响

微波可以促进植物细胞壁的破碎,使其溶出增加。由图1可知,微波功率对金刚藤粗多糖及多糖得率的影响趋势基本一致。随功率的增加,粗多糖及多糖得率均增加,当功率达到560W时,粗多糖、多糖的得率最大,当功率继续增大时,两者均有下降趋势,可能与过大的功率会使有效成分降解有关。因此,选择微波功率440、560、680W作为正交试验设计的因素水平。

图1 微波功率对粗多糖及多糖得率的影响

2.1.2 水料比对金刚藤粗多糖及多糖得率的影响

由图2可知,金刚藤粗多糖及多糖得率随水料比的变化较为一致,当水料比从10mL/g增加到30mL/g时,粗多糖及多糖得率迅速增加,但水料比超过30mL/g时,粗多糖及多糖得率开始下降。因此,提取溶剂不宜过多,选择水料比20、30、40mL/g作为正交试验设计的因素水平。

图2 水料比对粗多糖及多糖得率的影响

2.1.3 温度对金刚藤粗多糖及多糖得率的影响

由图3可以看出,在试验温度范围内,粗多糖及多糖得率随反应体系温度的升高而增加。温度在70℃～80℃时,两者的增加幅度最大,且粗多糖的增加更明显,80℃以后两者的增加幅度趋于平缓。因此选取80、90、100℃进行正交试验。

图3 温度对金刚藤粗多糖及多糖得率的影响

2.1.4 微波时间对金刚藤粗多糖及多糖得率的影响

由图4可知,金刚藤粗多糖及多糖的得率随提取时间的延长而增加,36min时达到最大,继续延长提取时间,两者的得率均下降,且提取时间对多糖得率的影响更为明显。选择微波时间为27、36、45min作为正交试验设计的因素水平。

图4 时间对金刚藤粗多糖及多糖得率的影响

2.2 正交试验

正交试验设计及结果如表1所示。各因素对粗多糖得率影响的主次顺序为温度>时间>水料比>微波功率,对多糖得率影响的主次顺序为温度>时间>微波功率>水料比,即微波处理对粗多糖和多糖得率的影响并不一致。最佳提取工艺组合均为A3B1C3D2,即微波功率680W,水料比20∶1,温度100℃,时间36min。该条件下金刚藤粗多糖和多糖的得率最高,与正交试验表中的结果相符合。由表2可知,微波功率、水料比、温度和时间对粗多糖及多糖得率的影响均达到极显著水平(P<0.01)。

表1 正交试验设计及结果

表2 正交试验方差分析结果

2.3 微波、热水提取多糖的含量测定

经测定,样品质量浓度与吸光度值之间的关系函数为:y=15.52x-0.1209,R2=0.9978。如表3所示,微波辅助提取的金刚藤粗多糖、多糖得率分别是热水提取粗多糖、多糖得率的1.48倍和1.36倍,但提取时间从120min缩短为36min,热水提取粗多糖的糖含量更高。

表3 微波、热水提取多糖的含量

2.4 多糖的结构测定

2.4.1 傅里叶红外光谱结构测定

由图5可以看出,热水、微波提取的多糖SCP-W和SCP-M在红外光谱结构上并没有明显的区别。3430cm-1、2930cm-1、1640cm-1附近是O-H、C-H、C=O的伸缩振动峰,是糖类的三个特征吸收峰,1157cm-1、1085cm-1和1015cm-1为吡喃糖环的特征吸收峰,854cm-1处的吸收峰说明具有α-型糖苷键。推测金刚藤多糖为α型吡喃糖,微波提取没有对金刚藤多糖的初级结构造成影响。

图5 SCP-M和SCP-W的红外光谱图

2.4.2 三螺旋结构测定

由图6可知,在NaOH溶液浓度从0到0.5mol/L逐渐增加时,阴性对照蒸馏水和热水提取的金刚藤多糖与刚果红形成络合物的λmax逐渐下降,而微波提取的金刚藤多糖与刚果红形成络合物的λmax先增加后下降。说明热水提取的金刚藤多糖没有三螺旋结构,但微波提取的金刚藤多糖具有三螺旋结构。推测微波可能会促进多糖高级结构的改变或者增加三螺旋结构多糖的溶出。

图6 SCP-M和SCP-W的三螺旋结构测定结果

2.5 金刚藤多糖的体外抗氧化活性活性测定

由图7a可知,SCP-M、SCP-W对DPPH自由基的清除率随多糖溶液浓度的增加,呈先增加后降低的趋势,在1.5mg/mL时分别为50.48%、57.47%,而在多糖浓度超过1.5mg/mL时测量DPPH自由基清除率,反应液变浑浊,有部分白色析出物,清除率降低。由图7b可知,SCP-M、SCP-W对ABTS自由基的清除率随多糖溶液浓度的增加而增加,且增加趋势先快后慢,在1.5mg/mL时分别达到87.52%、93.39%,之后趋于平稳,接近阳性对照Vc对ABTS自由基的清除率。

图7 SCP-M和SCP-W的体外抗氧化活性

2.6 体外降血糖活性

由图8可知,SCP-M、SCP-W对α-葡萄糖苷酶均具有较高的抑制作用,在1.5mg/mL时分别达到77.85%、86.48%,且随多糖溶液浓度的增加,抑制率亦呈逐渐增加的趋势,之后趋于平稳。SCP-M的抑制效果略低于SCP-W,且都低于阳性对照组阿卡波糖。即两种方式提取的多糖均有明显的体外降血糖功效,SCP-M的降血糖活性略低。

图8 SCP-M和SCP-W对α-葡萄糖苷酶抑制率测定

3 讨 论

多糖作为一种具有多种生物活性的高分子化合物,近年来受到了广泛关注。本研究采用正交试验考察了金刚藤多糖的微波辅助提取工艺。通过对粗多糖及多糖得率的对比分析,进一步了解了微波提取多糖的作用机制。微波处理的温度、时间、水料比、微波功率对粗多糖及多糖得率均有极显著的影响,且影响的主次顺序存在差异。随水料比的增加,溶剂与原料的反应更加充分,使多糖溶出增加,但过多的溶剂会吸收部分微波能量,使得作用于实际反应体系的能量相对降低,因而两者的得率呈现出先增加后减少的趋势,且过多的溶剂会增加后期浓缩的困难[11]。提取温度达到80℃时,微波释放的能量达到了裂解植物细胞壁所需的能量,对植物细胞壁的破坏作用越明显,多糖的溶出越多,但高温对多糖以外其他杂质溶出的效果可能更好,使得粗多糖的增加高于多糖的增加;提取时间过长时,提取液黏度增大,多糖溶出速度减慢,但部分已溶出的多糖发生了降解,且有其他水溶性杂质的溶出,导致多糖的相对得率降低[12]。Han等[5]、黄群惠等[13]的研究表明,长时间的微波处理会破坏糖链的网络结构,导致多糖抗氧化活性的下降。因此,微波提取时间不宜过长。最终选择,在微波功率680W,水料比20∶1(mL/g),温度100℃,提取时间36min时,粗多糖得率为(14.63±0.05)%,多糖得率为(8.11±0.19)%,分别是热水提取法的1.48倍和1.36倍,提取时间缩短了70%,具有得率高、耗时短的优点,证实了微波辅助提取工艺的优势。在本实验中,相较于热水提取的粗多糖,微波提取的粗多糖颜色较深,但因前期预实验发现除蛋白过程会影响多糖的生物活性,使后续活性探讨实验增加了变量,因此,控制两种粗多糖的除蛋白方法一致,计算微波辅助法提取多糖的糖含量略低,与Zhao等[14]的研究结果一致。

多糖的三螺旋结构分析表明,微波辅助提取的金刚藤多糖具有三螺旋结构,可能会在抗肿瘤等特定的生物活性方面具有一定的研究价值[15],目前尚未检索到微波处理与多糖三螺旋结构之间相关性的研究报道,其机理还有待探讨。

本实验中,SCP-M、SCP-W对DPPH和ABTS自由基在0.2～2.5mg/mL的浓度范围内,均有清除作用,且都低于阳性对照组Vc。同一浓度的两种多糖对ABTS自由基的清除效果均大于对DPPH自由基的清除效果,SCP-M对DPPH、ABTS自由基的清除效果略低于SCP-W。因此,微波提取的金刚藤多糖具有较好的抗氧化活性,略低于热水提取多糖的抗氧化活性。可能与其纯度有关,也可能与微波处理的效果过于剧烈[16],破坏了部分多糖的活性结构。杨梅酒渣多糖在0～10mg/mL范围内对ABTS和DPPH自由基的清除率呈浓度依赖式增加[17]。可能与金刚藤多糖的相对分子质量大于杨梅酒渣多糖,较高浓度的金刚藤大分子多糖在含乙醇的DPPH反应液中易于析出有关,所得试验结果低于实际数值。

综上所述,微波辅助提取工艺可应用于金刚藤多糖的提取,具有得率高、耗时短、生物活性显著的优点。研究可为多糖及金刚藤产业的发展提供参考。但对于微波辅助提取多糖的复杂结构分析及提取过程中各因素变化对多糖生物活性的影响没有做深入的探讨,还需要进一步的研究。