种鸡场鸡毒支原体不同免疫程序抗体消长规律的研究

张鹏，丁爱君，王怀娜，来庆梅，王海兰，郭龙宗，李玉燕

（山东益生种畜禽股份有限公司，山东 烟台 265508）

鸡毒支原体病（MG）又称为鸡慢性呼吸道病（CRD），是由鸡毒支原体引起的一种传染性疾病，主要表现为咳嗽、甩鼻、气管炎和气囊炎等呼吸道症状，鸡群可终身带菌，感染鸡群可引起产蛋率下降、受精率和孵化率降低，且可经蛋传播给下一代，影响家禽的健康生长，危害家禽生产及生殖性能。《中华人民共和国动物防疫法》规定鸡毒支原体病属于二类动物疫病，目前鸡场感染鸡毒支原体比较普遍，广泛存在于养鸡场环境中，感染途径多、净化难度较大，可引起鸡群反复发病，是养鸡场重点防控的主要禽病之一。

大多数养鸡场通过疫苗免疫防控MG。预防MG感染的疫苗主要有弱毒疫苗和灭活疫苗两种，常用的弱毒疫苗有TS-11、F 株、6/85 株疫苗，灭活疫苗主要有F 株、R 株、S-6 株油乳剂灭活苗等。在种鸡饲养过程中要根据不同的种鸡日龄和当地流行毒株的类型选择合适的疫苗免疫，多数企业采用弱毒苗和灭活苗相结合的免疫程序。 一般雏鸡在30～40 日龄滴鼻或点眼弱毒疫苗，在种鸡开产前16～19 周龄再免疫一次灭活苗加强免疫，可以起到较好的预防效果。探索鸡群在不同免疫程序产生的抗体高度、抗体维持时间以及疫苗的保护规律，能够有效地指导科学免疫，降本增效、健康养殖。因此，制定合理的免疫程序、选择适合的疫苗以及毒株种类、跟踪免疫后抗体高度并建立抗体基线是种鸡生产过程中的一项重要工作。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验对象和免疫程序 本试验所选试验鸡来自胶东某养殖集团的一个父母代肉种鸡场，存栏18 万套，品种为哈伯德肉种鸡，该场有20 个平养鸡舍。对父母代肉种鸡采用4 种不同的免疫程序进行免疫效果对比试验，免疫程序见表1。33 日龄，点眼免疫MG 弱毒疫苗，1 羽份/只；118 日龄，颈部皮下注射MG 灭活疫苗，0.5 mL/只。

表1 父母代肉种鸡不同试验对象的免疫程序

1.1.2 试验试剂 鸡败血支原体ELISA 抗体检测试剂盒购自荷兰BiocheK 公司，批号为FS9142，有效期至2024 年4 月3 日。RealPCR 败血支原体/DNA 检测混合液，购自IDEXX 公司，批号：44B1045，有效期至2024 年8 月8 日。

1.1.3 试验仪器 MK3 酶标仪（美国ThermoFisher公司）、 洗板机（TECAN 公司）、ABI Q5 荧光定量PCR 仪（QuantStudioTM5 Real-Time PCR Instrument）、移液器、2.5 mL 一次性无菌注射器、一次性无菌植绒棉签、1.5 mL 无菌离心管等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集

1.2.1.1 血清样本的采集 首先，制定详细的采样计划，随机抽样，跟踪检测MG 抗体。分别在4、7、13、16、19、26、34、42、52 周龄等不同时间点翅静脉采血，在每栋鸡舍以对角线方式随机挑选30 只鸡，一栋鸡舍9 个周龄共挑选270 只，一个组（5 栋鸡舍）共采血1 350 份，4 个组共采血5 400 份。待自然析出血清后，转移至离心管中-20 ℃冻存，血清样本禁止反复冻融。

1.2.1.2 咽喉拭子样本的采集 在免疫鸡毒支原体弱毒疫苗前（33 日龄前）采集咽喉拭子，每栋鸡舍内以对角线方式随机采集30 份，一个试验组5 栋鸡舍共采集150 份，检测MG 病原。咽喉拭子采集使用一次性无菌植绒棉签在鸡只上颚裂旋转3 圈，蘸取分泌物后放入1.5 mL 无菌离心管中，剪去多余的部分、盖紧离心管的盖子并做好标记、冷藏转运实验室。

1.2.1.3 气囊拭子样本的采集 试验鸡所产的种蛋按照不同免疫程序分组上孵，按照上孵时的分组，在28、34、42、52 周随机选取与种鸡对应周龄的啄壳毛蛋30 枚，共收集了480 枚，检测MG病原。无菌剪开啄壳雏鸡的胸腔，用一次性无菌植绒棉签在肺部及胸气囊旋转3～5 圈，采集气囊分泌物后放入1.5 mL 无菌离心管中，剪去棉签多余的部分，并在离心管上做好标记。

1.2.2 ELISA 检测 支原体抗体检测方法使用酶联免疫吸附试验（ELISA），检测依据为禽支原体病检测技术规范SN/T 1224-2012，具体实验操作按照BiocheK 鸡败血支原体病试剂盒说明书进行。检测所有试剂使用前需要恢复至室温2 h，血清样本解冻后要充分混匀，标记好孔位和样本信息进行500 倍稀释。试验终止后用酶标仪读取每一份样品的OD405数值，通过公式S/P 值=（样品OD 值-阴性对照平均OD 值）/（阳性对照平均OD 值-阴性对照平均OD 值）和Log10 滴度=1.1xLog10 S/P+3.156，计算样本S/P 值和滴度值，或通过BiocheK 分析软件进行计算。试剂盒判定标准：S/P值≥0.5为阳性或抗体滴度≥668为阳性。

1.2.3 荧光定量PCR 检测 鸡毒支原体病原采用荧光定量PCR (real-time PCR)检测方法，检测依据为禽支原体PCR 检测技术NY/T553-2015。荧光定量PCR 具体实验操作按照IDEXX 鸡败血支原体病试剂盒说明书进行。 根据试剂盒判定结果：阳性对照FAM Ct 值＜38，HEX（VIC）＜38；PCR 阴性对照FAM Ct 值无信号，HEX（VIC）≥36；实验有效。样本的FAM Ct 值＜38，HEX（VIC）＜38，判为阳性。

2 结果

2.1 MG 病原检测结果

四组不同免疫程序鸡群在整个试验过程中无MG 野毒感染。检测结果见图1。

图1 不同免疫程序下的MG病原检测结果（详见附录彩图）

2.2 MG 抗体检测结果

33 日龄免疫MG 弱毒疫苗，7～16 周监测MG抗体监测数据显示：免疫F-36 疫苗的平均抗体滴度在1 800 左右，免疫TS-11 疫苗的平均抗体滴度在1 200 左右，免疫6/85 疫苗的抗体为阴性。不同MG 弱毒苗免疫应答的强弱顺序为F-36 ＞TS-11 ＞6/85。不同免疫程序下各周龄抗体滴度平均值见表2。

表2 不同免疫程序下各周龄抗体滴度平均值

118 日龄加强免疫一次支原体油苗后，对抗体趋势产生影响，平均抗体滴度在3 000～6 000 之间，整个饲养过程中场区环境野毒载量极低。不同免疫程序下的MG 抗体趋势详见图2。根据结果显示：在无野毒感染的情况下，首免MG 活疫苗F-36 在加强油苗免疫前（4～16 周）的ELISA抗体平均滴度范围在115～1 817 之间，抗体阳性率可达7%～76%；首免MG 活疫苗6/85、二免油苗在免疫前4～16 周的ELISA 抗体平均滴度范围在10～559 之间，抗体阳性率全阴；首免MG活疫苗TS-11 在加强油苗免疫前（4～16 周）的ELISA 抗体滴度范围在7～1 202，抗体阳性率在20%～70%；全程只免疫1 次TS-11 活苗的鸡群，全程MG 抗体滴度不高于2 000，抗体阳性率在20%～70%；3 个加强油苗免疫组19～52 周 MG 抗体滴度均低于6 000。

图2 不同免疫程序下的MG抗体趋势（详见附录彩图）

3 讨论

鸡毒支原体弱毒疫苗毒株属于温度敏感型疫苗株，不能在高于39 ℃的条件下存活，而鸡的体温约为41.5 ℃，疫苗免疫后的增殖部位被局限在温度较低的上呼吸道部位刺激粘膜免疫，疫苗株需要在野毒感染前占位，故免疫前2 周和免疫后4 周不可使用对支原体有影响的抗生素。鸡毒支原体弱毒疫苗以细胞免疫为主，在评估弱毒疫苗免疫效果时，除了看抗体高度外还应考虑抗体转阳率。抗体滴度与保护率不呈正相关，但呈现降低致病性MG 感染的趋势。鸡毒支原体灭活疫苗以体液免疫为主，高滴度抗体对野毒垂直传播有一定的抑制作用，因此保证产蛋期鸡群的抗体高度和阳性率可以降低垂直传播风险。鸡毒支原体的免疫程序多选择弱毒苗与灭活苗相结合的方案，提高机体的免疫抗体高度和抗体阳性率，增加机体抵抗MG 水平传播感染的能力，控制垂直传播风险，维持鸡群健康。因此，制定科学的免疫程序、定期监测鸡群MG 抗体和MG 野毒病原是科学防控鸡毒支原体病、保障鸡群健康的重要环节。

有报道表明抗体高度与鸡群抗感染不具有相关性，但对于评估鸡群免疫效果、感染状况、降低鸡群垂直传播仍具有参考价值。根据本次试验数据可总结以下几点：在无野毒感染的情况下，只免疫MG 活疫苗F-36，6～12 周内ELISA 平均抗体滴度低于2 000，抗体阳性率可达100%；只免疫MG 活疫苗6/85 后，6～12 周内ELISA 抗体阳性率为阴性，如果抗体超过1 000、阳性率在10%～100%则考虑野毒感染；全程只免疫MG 活疫苗TS-11 组，4～52 周ELISA 平均抗体滴度范围在1 000～2 000，抗体阳性率在30%～70%，如果抗体超过5 000、阳性率高于90%则考虑野毒感染；3 个加强油苗免疫组，19～52 周 MG 抗体均低于6 000，若抗体滴度平均值在8 000 以上，则存在MG 野毒感染。因此，本试验不同MG 活疫苗和油苗免疫组合建立的抗体基线模型可为MG 野毒感染的评估提供重要参考依据。