乌苏酸对人胰腺癌细胞PANC-1 增殖和凋亡的影响

金俊华，赵承伟，付 佳，郑桂茹△

（1. 浙江省金华市人民医院药剂科，浙江金华 321000； 2. 温州医科大学药学院＜诸暨＞生物医药研究院，浙江诸暨 311800）

胰腺癌（PC）为恶性程度极高的肿瘤疾病，病情进展快，预后极差，5年生存率低于6%［1-2］。近年来，我国PC 总体发病率和死亡率均呈增长趋势。有Ⅲ期临床试验报道，厄洛替尼联合吉西他滨（GEM）较GEM 单药治疗的生存获益显著，患者的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）均得到一定延长［3］，但获益时间有限，且伴随强烈的药品不良反应。乌苏酸（UA）又称熊果酸，属乌苏烷型三萜类化合物，在植物中分布广泛［4］。有研究表明，UA 主要从诱导肿瘤细胞凋亡［5］、自噬［6］，抑制肿瘤细胞转移［7］、炎性反应［8］、上皮-间充质转化［9］、肿瘤血管生成［10］，逆转放射治疗和化学药物治疗（简称放化疗）药物的耐药性［11］，阻滞细胞周期［12］，调节免疫功能［13］等方面发挥抗肿瘤作用，但是对PC 的作用并不明确。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是细胞内重要的生存信号通路，其激活与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、化疗耐药性及血管生成密切相关［14］。抑制该通路的激活可阻止肿瘤细胞的生长、增殖，促进凋亡［15］。本研究旨在探讨UA对人胰腺癌细胞PANC-1活性、迁移、增殖、凋亡等的影响，并研究PI3K/Akt/mTOR 信号通路在PC发生、发展中的作用，为开发PC治疗新药提供思路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：MIKRO 200R/ 220R 型台式离心机（德国Hettich 公司）；CKX41 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；INCO108-246型二氧化碳细胞培养箱（德国Memmert 公司）；Synergy 超纯水系统（美国Millipore 公司）；1600 型凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；IC1000 型细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）；Synergy H1 型多功能酶标仪（美国BioTek 公司）；DK -S22 型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；IMMULITE®2000 XPi 型免疫分析系统（西门子＜ 中国＞ 有限公司）；KQ3200E 型超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；AL104型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；GL-802A型台式小型真空泵（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

试药：UA（CAS：77 - 52 - 1，含量> 99%），二甲基亚砜（DMSO，CAS：67 - 68 - 5，含量> 99.9%），均购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；GEM（美国Med-ChemExpress 公司，批号为HY-17026）；DMEM 培养基（美国Sigma公司，批号为D6429）；1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺、胎牛血清（美国Gibco 公司，批号分别为10378016，10099141C）；PI3K，磷酸化蛋白激酶B（p -Akt），Akt，磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR），mTOR，β - Actin、活化半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3），B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2），Bcl-2 关联X 蛋白（Bax）一抗（美国Cell Signalling Technology 公司，批号分别为#4249，#4060，#5536，#9272，#2972，#3700，#9661，#4223，#2772）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（生工生物工程＜ 上海＞ 股份有限公司，批号为D110058）。

细胞：人胰腺癌细胞株PANC-1（中国科学院上海细胞库）。

1.2 方法

细胞培养：细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素- 链霉素双抗的DMEM 培养基（以下简称培养基）中，置37 ℃及饱和湿度，5%CO2的条件下培养，待细胞贴壁生长2～3 d后釆用胰蛋白酶消化。

细胞活性：采用四氮唑盐（MTT）法。取细胞，置96孔板中孵育（细胞密度3×103个/孔）。分别加入不同浓度的UA（1.25，2.5，5.0，10.0，25.0，50.0µmol/L）和GEM（0.16，0.31，0.63，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0µmol / L）；对照细胞加入等体积的DMSO。设6 个复孔。培养24，48，72 h后加入5 mg/mL MTT溶液20µL，继续培养4 h，吸去上清液，各组加入DMSO 150 µL，振荡2 min 至晶体完全溶解。在570 nm 波长处检测吸光度值（OD）。细胞存活率（%）=OD实验细胞/OD对照细胞×100%。

细胞形态：取对数生长期的细胞，制成细胞密度为2 × 105个/mL 的混悬液，取1 mL 于12 孔板中，实验设对照1 组（等体积DMSO），UA 低、中、高剂量组（5，10，20 µmol/L），各组细胞相应培养24 h 后，电子显微镜下观察细胞形态学变化，并拍照记录。

细胞增殖：采用集落形成实验。取细胞，接种于6孔板中（细胞密度为1×103个/孔）。实验分组同“细胞形态”项，各组细胞予相应处理，设置3个复孔。培养5 d后显微镜下观察直径大于0.5 mm的细胞集落数。

细胞迁移：采用细胞划痕实验。实验设对照2组（等体积DMSO）和UA 组（10µmol/L）。取细胞，接种于6孔板中（细胞密度为5×105个/孔），待生长至80%汇合度时除去培养基，用20µL 移液枪头末端刮擦产生划痕，加入培养基，各组细胞予相应处理，分别培养48 h和72 h后，显微镜下观察细胞的迁移情况。

蛋白表达水平：采用Western blot 法。实验分组同“细胞形态”项，各组细胞予相应处理48 h，用胰蛋白酶消化并离心，加入细胞裂解缓冲液，冰上裂解细胞。4 ℃、12 000 r/min 离心20 min，取上清液。用BCA 法测定蛋白质含量，加入等体积2 × loading 缓冲液，混合并煮沸10 min使蛋白质变性，凝胶电泳后转膜，封闭2 h，加入PI3K，p - Akt，Akt，p - mTOR，mTOR，Cleaved Caspase-3，Bcl-2，Bax，β-actin抗体（1∶1 000，V/V）4 ℃下过夜。以羊抗兔二抗（1∶5 000，V/V）室温振摇1 h，洗膜3 次，置凝胶成像仪扫描成像，使用Image J 软件分析条带，以β-actin 条带平均光密度为参考，计算目的蛋白的相对表达量。

分子对接模拟：从蛋白数据库下载目标蛋白PI3K（PDB ID：3APD［16］）和Akt 2（PDB ID：3E8D［17］）用薛定谔分子对接软件（2018 版）预处理蛋白，生成对接盒子，使用UA 结构进行模拟对接，查看评分结果，对接结果图以PyMOL软件导出或Ligand interaction键生成。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism 10.0统计学软件分析。计量资料以±s表示，行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞活性

GEM 和UA 对细胞活性的影响见图1（因GEM 疗效确切，故未进行48 h 及72 h 实验）。可见，随着UA 药物浓度的升高，细胞活性逐渐减弱，且有剂量依赖性。在24 h 时，UA 的IC50为7.89 µmol / L，显示出与上市药物GEM（IC50= 2.20 µmol / L）相同数量级的肿瘤细胞活性抑制效果。UA 在48 h 和72 h 时的IC50分别为6.26µmol/L和5.06µmol/L。

图1 细胞活性A.Gemcitabine B.Ursolic acidFig.1 Cell viability

2.2 细胞形态

对照1 组细胞形态正常，贴壁，呈不规则梭形或圆形，细胞生长状态较好。UA 各剂量组细胞随着浓度的增加，逐渐失去原有形态，变形细胞数量随之增加，细胞边界模糊不清，贴壁细胞数量变少，部分细胞悬浮于培养基中，细胞显示出较差的生长特点。详见图2。

图2 细胞形态Fig.2 Cell morphology

2.3 细胞增殖

与对照1 组比较，UA 各剂量组细胞数量均显著减少（P＜0.05），且呈一定的浓度依赖性。详见图3。

图3 细胞增殖能力A.Photos B.Data statisticsNote：Compared with those in the control group one，*P ＜ 0.05，**P ＜0.01（for Fig.3 and Fig.5 - 6）.Fig.3 Cell proliferation

2.4 细胞迁移

与对照2 组比较，UA 组细胞48 h 和72 h 的迁移距离缩短。详见图4。

图4 细胞迁移情况Fig.4 Cell migration

2.5 相关蛋白表达水平

与对照1组比较，UA各剂量组细胞Cleaved Caspase-3及Bax 的表达水平均显著升高（P＜0.05）；UA 中、高剂量组细胞Bcl - 2 表达水平均显著降低（P＜ 0.05）；UA高剂量组细胞PI3K 表达水平，UA 中、高剂量组细胞p-Akt 表达水平，UA 各剂量组细胞p-mTOR 表达水平均显著降低（P＜0.05）。详见图5、图6。

图5 细胞中凋亡相关蛋白表达水平A.Electropherograms B.Data statisticsFig.5 Expression levels of apoptosis - related proteins in cells

图6 细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达水平A1，A2.Electropherograms B.Data statisticsFig.6 Expression levels of PI3K / Akt / mTOR signaling pathway - related proteins in cells

2.6 分子对接

结果见图7。可见，UA 中的乌苏烷型三萜类结构可进入PI3K 与Akt2中三磷酸腺苷（ATP）结合位点竞争性结合疏水口袋，从而影响PI3K，Akt2 蛋白与ATP 的结合，抑制其激活。其中UA 结构中的羧酸部分，可与PI3K蛋白中的Lys890，Thr887 产生氢键相互作用。UA 中的羟基部分也可与Akt2中的Asp293产生氢键相互作用。

图7 分子对接结果A.Ursolic acid and PI3K B.Ursolic acid and Akt2Fig.7 Results of molecular docking

3 讨论

PC 的发病率与死亡率相近，仅20%的患者可通过手术切除获得长期生存［18］。PC 相较于其他实体肿瘤具有解剖结构特殊、富间质、高度异质性、细胞恶性潜能大及肿瘤代谢模式异常等特点。临床治疗PC 的主要手段是手术切除，但切除后仍有复发的可能。非手术疗法有放疗、化疗、靶向药物治疗及传统中医药辅助治疗［19-20］。免疫疗法、内分泌疗法作为新兴的治疗手段［21］，其疗效并不确定。故临床迫切需要开发新型PC治疗药物和方法来提升PC 的治疗效果。中医药作为肿瘤辅助联合治疗的重要组成部分，有其独特的治疗优势。UA 由于抗瘤谱广，对正常细胞毒性低，同时具有免疫增强功能，其抗肿瘤作用日益受到关注［22］。本研究结果显示，极低浓度GEM 和UA 有可能促进细胞增殖；UA具有抑制PANC- 1 细胞活性的效果，且在DMEM 培养基中培养24 h 的IC50与GEM 处在同一个数量级；且UA可影响PANC-1细胞形态，诱导其凋亡，抑制增殖。

PI3K/ Akt/ mTOR 信号通路的作用机制包括细胞受生长因子等的刺激后，PI3K 激活并聚集到细胞膜上，将其底物3，4 - 二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）转化为3，4，5 - 二磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），PIP3 再激活其下游的Akt 蛋白等。PIP3 通过与Akt 的PH 结构域相互作用，聚集Akt 到细胞膜上，并通过3-磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK-1）将其Thr308 和羧基端的Ser473 位点同时磷酸化，激活后的p-Akt蛋白再转移，通过直接或间接途径激活下游的mTOR，调节蛋白质合成，基因转录等，从而达到对细胞生存和凋亡的调控［23］。随着研究的不断深入，PI3K/Akt/mTOR 信号通路所涉及的多种下游信号分子在许多常见肿瘤的发生、发展过程中的重要角色也日益凸显，针对该信号通路的关键分子靶点的肿瘤治疗策略令人期待［24］。本研究结果显示，UA 能降低PANC - 1 细胞中PI3K，p - Akt，p - mTOR 的蛋白表达水平，抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路的激活影响肿瘤功能，以及上调凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Bax，下调Bcl-2诱导PANC-1细胞的凋亡。分子对接结果发现，UA中的乌苏烷型三萜类结构可与PI3K和Akt2蛋白相互作用，从而影响蛋白质功能，抑制其激活。

综上所述，UA 作为多靶点抗肿瘤天然产物，在体外能显著抑制PANC-1细胞的增殖，诱导细胞凋亡，抑制细胞迁移，其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路的激活和影响凋亡相关蛋白Cleaved Caspase - 3，Bax，Bcl-2表达相关。