不同配伍比例大黄-丹参有效成分溶出率及抗模型大鼠肾纤维化作用比较*

2024-01-26徐子寒高俪原

中国药业 2024年2期

孟颖，徐子寒，高俪原，韩怡

（江苏省张家港市中医医院，江苏张家港 215600）

慢性肾脏病（CKD）是全球性公共卫生问题［1］，目前全球有6.98 亿病例，中国患者达1.323 亿［2］。肾纤维化是CKD 的标志，也是肾功能进行性改变和不可逆转的重要原因［3］。相较于西药，传统中医药对CKD 具有独特的治疗优势。大黄为泻下良药，具有逐瘀破结功效；丹参为活血化瘀良药；两药配伍，为中医临床治疗CKD 的高频使用药对［4-5］。近年来，含大黄-丹参药对的中成药如肾康注射液（大黄- 丹参，1∶1）［6］和肾衰宁胶囊（大黄-丹参，1∶1.75）［7］，临床经验方如抗纤灵冲剂（上海中医药大学附属曙光医院，大黄-丹参，1∶1.25）［8］，固本泄浊饮（张家港市中医医院，大黄- 丹参，1∶2）［9］等广泛用于临床，疗效均较好。已有研究多集中于大黄、丹参单味药材或其单体成分治疗CKD 肾纤维化［10-12］，药对也仅限于1∶1 配伍［13-14］，两药不同配伍比例下的有效成分及疗效未见研究。为此，本研究中探讨了不同配伍比例大黄-丹参对有效成分溶出率及抗模型大鼠肾纤维化的作用。现报道如下。

1 仪器、试药与动物

1.1 仪器

e2695 型高效液相色谱仪，包括PDA2998 型检测器（美国Waters 公司）；MS105 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司），7170A 型全自动生化分析仪（日本Hitachi公司），精度均为0.01 mg；SCQ - 250 型超声波清洗器（上海声彦超声波仪器有限公司）；ST16R型低温离心机（美国Thermo Fisher公司）。

1.2 试药

芦荟大黄素对照品（批号为PRF9022841，含量97.72%），大黄酸对照品（批号为PRF9083142，含量98.36%），大黄素对照品（批号为PRF8070501，含量99.44%），大黄酚对照品（批号为PRF8022726，含量99.67%），大黄素甲醚对照品（批号为PRF9031428，含量97.24%），均购于成都普瑞法科技开发有限公司；丹参酮ⅡA对照品（批号为MUST - 20121710，含量99.56%），丹酚酸B 对照品（批号为MUST - 21030110，含量98.60%），均购于成都曼斯特生物科技有限公司；磷酸、甲醇均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。大黄饮片（批号为210527010），丹参饮片（批号为210710010），均购于苏州天灵中药饮片有限公司，经张家港市中医医院余辉主任中药师鉴定为正品。

1.3 动物

SPF级SD大鼠35只，雄性，7周龄，体质量（180±10）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号SYXK（京）2022-0025。饲养于南京中医药大学实验动物中心，室温（23±2）℃，相对湿度（60±5）%，12 h 明暗交替，实验期间大鼠自由进食饮水。本实验经我院实验动物伦理委员会批准（批件号：2020 伦申第1040号）。

2 方法与结果

2.1 有效成分溶出率研究

2.1.1 色谱条件

色谱柱：ThermoHypersilBDSC18柱（250mm×4.6mm，5 µm）；流动相：乙腈（A）- 0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～5 min时5%A，5～15 min时5%A →30%A，15～25 min时60%A，25～35 min 时60%A →75%A，35～45 min 时75%A，45～65 min时75%A →5%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：35 ℃；进样量：10µL。

2.1.2 溶液制备

大黄混合对照品溶液：称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品各适量，精密称定，分别置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成单一对照品溶液①- ⑤（质量浓度分别为0.996 7，0.946 2，0.938 7，1.521 0，0.958 8 mg / mL）。分别精密吸取740，740，660，1 400，660µL，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容，制成混合对照品溶液Ⅰ（质量浓度分别为73.756，70.019，61.954，212.940，63.281µg/mL）。

丹参混合对照品溶液：称取丹酚酸B、丹参酮ⅡA对照品各适量，精密称定，分别置5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成单一对照品溶液⑥和⑦（质量浓度分别为1.312 2 mg/ mL 和1.366 6 mg/ mL）。分别精密吸取1 800µL 和940µL，置同一10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释并定容，制成混合对照品溶液Ⅱ（质量浓度分别为236.196µg/mL和128.460µg/mL）。

大黄、丹参单提液：分别取大黄饮片、丹参饮片样品各适量，置陶瓷煲中，加水300 mL，武火煮沸后转文火继续煎煮30 min，滤过，除去药渣，药液浓缩并定容至100 mL，精密吸取药液25 mL，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，30 ℃下超声（功率200 W，频率45 kHz）提取10 min，冷却至室温，取上清液，经0.45µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

不同配伍比例大黄- 丹参混提液（供试品溶液）：按大黄-丹参配伍比例1∶1、1∶1.25、1∶1.75、1∶2、1∶3、1∶4 分别称取大黄饮片样品粉末3.0 g（6 份）及丹参饮片样品粉末3.0，3.75，5.25，6.0，9.0，12.0 g，精密称定，分别提取并配伍制备，得供试品溶液①-⑥；按相同配伍比例分别称取丹参饮片样品粉末15.0 g（6份）及大黄饮片样品粉末15.0，12.0，8.57，7.5，5.0，3.75 g，精密称定，分别提取并配伍制备，即得供试品溶液⑦-○12。

2.1.3 方法学考察

系统适用性试验：取上述对照品溶液、供试品溶液各适量，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，理论板数按丹酚酸B 峰计应不低于3 000；分离度均大于1.5，基线分离良好。详见图1。

图1 高效液相色谱图1.Salvianolic acid B 2.Aloe - emodin 3.Rhein 4.Emodin 5.Tanshinone ⅡA 6.Chrysophanol 7.PhyscionA.Mixed reference solution Ⅰ B.Mixed reference solution Ⅱ C.Test solution ⑥ D.Extract of Rhei Radix et Rhizoma E.Extract of Salviae Miltiorrhizae Radix et RhizomaFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密量取2.1.2项下单一对照品溶液①-⑦0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成系列单一对照品溶液。精密量取10µL，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程。结果见表1。

表1 线性关系考察结果Tab.1 Results of the linear relation test

精密度试验：取2.1.2项下混合对照品溶液Ⅰ和Ⅱ，按2.1.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、丹酚酸B、丹参酮ⅡA峰面积的RSD分别为0.61%，0.58%，0.46%，0.42%，0.79%，0.52%，0.44%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液⑥适量，分别于室温下放置0，2，4，8，16，24 h时按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、丹酚酸B、丹参酮ⅡA峰面积的RSD分别为1.01%，1.23%，0.99%，1.16%，0.92%，1.01%，1.23%（n=6），表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验：称取饮片样品适量，精密称定，各6 份，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、丹酚酸B、丹参酮ⅡA峰面积的RSD分别为0.41%，0.39%，0.43%，0.35%，0.58%，0.38%，0.51%（n= 6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的饮片样品适量，共6 份，分别加入一定质量浓度的混合对照品溶液Ⅰ和Ⅱ，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.1.4 样品含量测定

取饮片样品各适量，分别按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积，计算样品含量及溶出率。结果见表3、图2。

表3 不同配伍比例大黄-丹参药对中7个有效成分含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of seven active ingredients in Rhei Radix et Rhizoma - Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma drug pair with different compatibility proportions（mg/g，n=3）

图2 不同配伍比例大黄-丹参药对中7种有效成分溶出率折线图Fig.2 Line graphs of dissolution rates of seven active ingredients in Rhei Radix et Rhizoma - Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma drug pair with different compatibility proportions

2.2 抗单侧输尿管梗阻（UUO）模型大鼠肾纤维化研究

建模、分组及给药：将35只大鼠随机分为假手术组（纯净水）、模型组（纯净水）、大黄组（大黄单提液）、丹参组（丹参单提液）、大黄-丹参（1∶1.25）组（1∶1.25 组）、大黄-丹参（1∶1.75）组（1∶1.75组）、大黄-丹参（1∶2）组（1∶2组）。大鼠禁食不禁饮12 h后，腹腔注射2.0%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，左侧腹切口，暴露并分离左侧输尿管，在肾盂开口处和输尿管上1/3 处结扎，从2 个结扎点中间剪断左侧输尿管，逐层缝合，并注射青霉素，以复制UUO 大鼠模型。各组灌胃纯净水或相应剂量煎液，按普通成人（体质量以60 kg 计）10 g/d 的中药量计，大鼠剂量为1.042 g/ kg，每天1 次，持续2 周。假手术组大鼠仅腹腔游离左侧输尿管后缝合腹腔。

肾脏病理形态：取大鼠左侧肾组织，将制得标本置4%多聚甲醛固定液中，脱水、包埋、切片，Masson 染色，观察病理改变。结果表明，与假手术组比较，模型组肾间质蓝色区域显著增多，大量胶原纤维沉积，肾纤维化明显；与模型组比较，各给药组中胶原纤维沉积减少，肾脏纤维化程度降低，其中大黄组肾损伤改善作用更优。详见图3。

图3 大鼠肾脏病理形态（Masson，×400）Fig.3 Pathological morphology of kidney in rats（Masson，× 400）

肾脏生化指标：用全自动生化分析仪检测大鼠血尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）、24 h 尿蛋白（24 h -UTP）水平。与假手术组比较，模型组大鼠BUN 和SCr水平显著升高（P＜ 0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠BUN，SCr，24 h-UTP 水平均显著下降（P＜0.05）。但各给药组组间无显著差异（P>0.05），大黄组SCr 显著优于丹参组。详见表4。

表4 各组大鼠肾功能指标比较（±s，n=5）Tab.4 Comparison of renal function indexes in each group（±s，n=5）

注：与假手术组比较，*P ＜ 0.05；与模型组比较，#P ＜ 0.05；与大黄组比较，△P ＜ 0.05。Note：Compared with those in the sham surgery group，*P ＜ 0.05.Compared with those in the model group，#P ＜ 0.05. Compared with those in the Rhei Radix et Rhizoma group，ΔP ＜ 0.05.

24 h-UTP（mg）5.26±1.10 14.90±2.29*8.13±0.70#9.07±1.29#8.59±0.85#8.51±1.41#8.94±0.70#组别假手术组模型组大黄组丹参组1∶1.25组1∶1.75组1∶2组BUN（mmol/L）5.98±0.69 16.01±1.29*9.65±1.27#11.72±0.74#10.71±1.58#10.58±1.16#11.57±1.02#SCr（µmol/L）22.99±3.29 56.03±6.60*36.41±4.91#46.50±3.52#△42.50±4.59#43.44±4.82#44.41±4.65#

3 讨论

3.1 大黄-丹参药对现代药理学

大黄通腑泄浊，具有推陈致新、清泄浊毒之功效。现代药理学研究发现，大黄具有抗炎、抗菌、通便、抗癌等药理作用，大黄提取物具有改善肾损伤、抑制肾组织细胞凋亡和炎性因子释放等功效［15］。丹参活血化瘀，具有祛瘀生新、通行血脉之效。现代药理学研究发现，丹参提取物具有减轻肾脏炎性反应，修复肾损伤，改善肾功能等功效［16-17］。王宏等［14］发现，大黄- 丹参药对可减轻慢性肾衰竭模型大鼠肾间质炎性细胞浸润、纤维化程度和结肠上皮屏障结构损伤程度，从而有效保护模型大鼠肾功能。大黄- 丹参药对也可显著抑制UUO模型大鼠肾组织中miR - 21/PTEN/Akt 信号通路，从而发挥对肾纤维化的改善作用［13］。

3.2 大黄-丹参药对配伍比例选择

2020年版《中国药典（一部）》规定大黄的用量为3～15 g，丹参的用量为10～15 g；临床以大黄治疗肾病的常用剂量为6～30 g［18］，丹参为10～37.3 g［19］。结合大黄丹参汤、抗纤灵冲剂、固本泄浊饮等含大黄-丹参药对的中药复方对肾脏疾病的临方遣药经验［20-22］，本研究中选择了大黄-丹参药对临床使用较多的6 种配伍比例，研究大黄-丹参混提液中7个有效成分溶出率的变化规律。

3.3 不同配伍比例对大黄- 丹参药对中7 个主要有效成分溶出率的影响

从溶出率测定结果可知，大黄-丹参混提液中7个有效成分含量均低于大黄、丹参单提液；大黄中5 个游离蒽醌的溶出率随着与丹参配伍比例改变的变化规律不一致，当大黄-丹参配伍比例为1∶2时，5个游离蒽醌的总溶出率最高（72.22%）；丹参中2 个有效成分总量随着丹参配伍比例的增大总体呈上升趋势，当大黄-丹参配伍比例为1∶2 时，丹酚酸B 和丹参酮ⅡA的总溶出率最高为91.35%；从7个有效成分总量来看，在大黄-丹参配伍比例为1∶2 时的溶出率最高（79.61%）。综合考虑，选取溶出率相对较高的大黄-丹参3种不同配伍比例（1∶1.25、1∶1.75、1∶2）及大黄、丹参单提液共5 组进行药效学最佳配伍比例研究。

3.4 不同配伍比例对UUO 模型大鼠肾纤维化的影响

由药效学实验结果可见，给药后大黄、丹参及其配伍均能显著提升模型大鼠的BUN，SCr，24 h - UTP 水平，大黄- 丹参配伍后在抗肾纤维化作用方面未产生协同作用，其中大黄单提液药效表现最佳，其余配伍比例无显著差异。病理学检测结果与药效一致，各给药组大鼠肾脏纤维化程度均明显降低，其中大黄单提液改善肾纤维化作用更优。