骨宝胶囊对糖皮质激素诱导骨质疏松大鼠骨密度、骨微结构的影响

郭金星，田增辉，盛夏，郝延科

（1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014）

糖皮质激素性骨质疏松症（glucocorticoidinduced osteoporosis，GIOP）是一种以骨丢失、骨量减少、骨组织微结构破坏为特点的继发性骨质疏松症，是长期或高剂量糖皮质激素（glucocorticoids，GC）使用后最常见的不良反应之一［1-2］。目前GIOP的治疗以促进骨生成，抑制骨破坏的西药治疗为主，但其弊端正逐渐被世人认知，造成诸多不良反应。流行病学调查显示，风湿性疾病患者骨质疏松症发病率高达80%以上，且骨量下降与GC累积使用时间呈正相关，但我国GIOP患者使用抗骨质疏松药物尚未规范，约1/3的患者从未接受任何治疗，从而导致骨折风险增加［3］。

中医学对GC虽无明确记载，但《素问·阴阳应象大论》中提到“壮火食气，少火生气”，意为“壮火之品”易致气血亏虚，“少火之品”令人气血旺盛［4］。中医将GC归为 “壮火之品”，初用耗气伤津，久之则损伤脏腑、气血、阴阳［5］。

关于GIOP的治疗一直是药物研究的热点问题，骨宝胶囊作为山东中医药大学附属医院制剂科经典自制药，已经在临床上得到广泛应用，早期研究表明，长期服用可改善GIOP（肝肾不足证）［6］。本次实验研究旨在通过观察骨宝胶囊对GC诱导下骨质疏松大鼠的影响，进一步明确骨宝胶囊在GIOP中对提高骨密度、改善骨微结构的疗效，为今后骨宝胶囊在临床上对GIOP患者的应用提供有力证据。

1 材料

1.1 实验动物

3月龄SPF级雄性Wistar 大鼠40只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2021-0006，体质量（200±20）g。所有动物均在山东中医药大学SPF级动物实验中心饲养，并且在清洁、干燥、通风、恒温、相对湿度（50±5）℃的适宜条件下进行饮食，实验所需饲料、净化水、垫料均由山东中医药大学实验动物中心提供。本实验符合规范并通过了山东中医药大学实验动物福利伦理审查，批准文号：SDUTCM20220314001，并在实验中心指导下开展实验。

1.2 实验药物

骨宝胶囊（规格：0.25 g/粒、批号：Z01080550），由鹿角胶、骨碎补、淫羊藿、白芍、当归、甘草组成，上述药材均由山东中医药大学附属医院制剂科严格按照工艺制备而成；地塞米松磷酸钠注射液（规格：1 mL∶5 mg，批号：H14022567，石药银湖制药有限公司）；钙尔奇D（规格：600 mg/片、批号：H10950029，惠氏制药有限公司）。

1.3 试剂与仪器

血清钙、血清磷、碱性磷酸酶测定试剂盒（批号：2022003、2022004、2021003，长春汇力）；无水乙醇、二甲苯（批号：100092683、10023418，国药集团化学试剂有限公司）。

离心机（型号：Centrifuge 5810 R型，德国Eppendorf）；烤箱（型号：GFL-230型，天津市莱玻瑞仪器设备有限公司）；卧式冷冻箱（型号：BCD-318AT型，中科美菱）；Micro-CT（型号：SkyScan 1276型，德国Bruker）；全自动生化分析仪（型号：Chemray 240型，深圳雷杜生命科技）；电子天平（型号：ME203E/02型，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；实验室超纯水机（型号：AK-RO-C2型，艾肯水精灵）；包埋机（型号：JB-P5型，武汉俊杰电子有限公司）；病理切片机（型号：RM2016型，上海徕卡仪器有限公司）；正置光学显微镜（型号：Eclipse E100，日本尼康）。

2 方法

2.1 实验分组、造模、给药、取材

对40只健康3月龄的雄性Wistar大鼠进行适应性饲养，1周内无死亡及其他异常后，随机分为空白组、模型组、给药组（骨宝胶囊）和对照组（钙尔奇D），每组10只。除空白组外，其余3组采用腹腔注射方式注射地塞米松磷酸钠注射液（2.5 mg/kg），空白组予以等体积0.9%氯化钠注射液（2.5 mL/kg）腹腔注射，每周2次（周二，周五），为期8周。8周后各组随机选择3只大鼠进行CT检测，发现造模组较空白组骨密度较低，骨小梁稀疏，排列不均匀，提示造模成功。将药物溶于蒸馏水配制相应浓度的灌胃溶液，冷藏保存，上午8时给药，1次/d，给药剂量参照药理学标准体重动物的mg/kg剂量折算表［7］，给药组给予0.4 g/（kg·d）骨宝胶囊，对照组给予60 mg/（kg·d）钙尔奇D，空白组、造模组予以等体积生理盐水灌胃，连续12周，所有动物灌胃体积均为1 mL/kg。灌胃结束后，腹腔注射2%戊巴比妥钠，观察大鼠，待大鼠对外界刺激无应答麻醉完全后取材。

2.2 样本采集及检测

2.2.1 血清ELISA检测

腹主动脉取血，将全血标本放于室温静置，2 h后置入离心机，4 ℃低温离心30 min（3 000 r/min），移液枪提取上清，EP管密封后置于-20 ℃冰箱中待测。按血钙、磷、碱性磷酸酶生化ELISA检测试剂盒要求进行检测，用全自动生化分析仪进行数据分析。

2.2.2 骨密度的测量和Micro-CT

取左侧股骨，仔细剔除附着肌肉和软组织，剥离完全后组织固定液固定，采用Micro-CT扫描，利用NRecon三维重建图像，使用 CT Analyser分析选定区域。统一标准后，测得骨密度（BMD）、骨体积比（BV/TV）、骨小梁数（Tb.N）和骨小梁分离度（Tb.Sp）等参数。

2.2.3 苏木精-伊红染色

取右侧股骨，用生理盐水清洗，并于甲醛溶液中固定48 h。脱钙液脱钙后每3 d更换一次液体，石蜡包埋后切片，按常规苏木精-伊红染色步骤：石蜡切片脱蜡、苏木素染色、伊红染色、脱水封片，显微镜下观察分析组织病理学变化。

2.3 统计学方法

使用Microsoft Excel进行记录和格式整理，SPSS25.0和GraphPad Prism9.0软件对所有数据进行统计分析。实验结果用±s表示，判断数据是否服从正态分布，若具备正态分布且方差齐，则采用单因素方差分析（one-way-ANOVA），若服从正态分布但方差不齐则采用非参数检验。P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组血清生化指标的比较

模型组大鼠血钙水平明显低于空白组（P＜0.05），给药组和对照组血钙水平均有显著提高（P＜0.05）。模型组血磷、碱性磷酸酶与空白组比较无统计学意义（P＞ 0.05），给药组血磷、碱性磷酸酶与模型组比较无统计学意义（P＞ 0.05）。见表1。

表1 各组血清生化指标比较（±s）

表1 各组血清生化指标比较（±s）

注：与空白组比较，△P ＜ 0.05；与模型组比较，▲P ＜ 0.05。

组别空白组模型组给药组对照组碱性磷酸酶/（U/mL）134.72±20.81 128.14±23.55 136.19±33.10 118.38±26.66 n7 7 7 7血钙/（mmol/L）2.06±0.06 1.91±0.01△2.07±0.05▲2.09±0.05▲血磷/（mmol/L）1.86±0.15 1.82±0.11 1.78±0.18 1.84±0.20

3.2 各组骨密度相关参数

模型组大鼠BMD明显低于空白组（P＜ 0.05），说明糖皮质激素诱导骨质疏松大鼠模型成功。给药组BMD较模型组有显著提高（P＜ 0.05），而给药组与对照组BMD水平比较无统计学意义（P＞ 0.05），说明骨宝胶囊和钙尔奇D对治疗骨质疏松均有不错疗效。模型组大鼠BV/TV、Tb.N和Tb.Sp较空白组明显降低（P＜ 0.05）。与模型组相比，给药组BV/TV、Tb.N提升显著（P＜ 0.05），Tb.Sp下降明显（P＜ 0.05）。与对照组比较，给药组BV/TV显著升高 （P＜ 0.05），而Tb.N、Tb.Sp无统计学意义（P＞ 0.05）。见表2。

表2 各组大鼠股骨骨密度、骨相关参数比较（±s）

表2 各组大鼠股骨骨密度、骨相关参数比较（±s）

注：与空白组比较，△P ＜ 0.05；与模型组比较，▲P ＜ 0.05；与对照组比较，*P ＜ 0.05。

组别空白组模型组给药组对照组n7 7 7 7 BMD/（g/cm3）0.41±0.06 0.15±0.06△0.38±0.06▲0.36±0.02▲BV/TV/%36.79±2.96 12.64±6.13△67.13±5.02▲*52.87±2.01▲Tb.N/（L/mm）2.85±0.57 0.91±0.44△3.81±0.21▲3.78±0.12▲Tb.Sp/mm 0.17±0.05 0.84±0.41△0.16±0.03▲0.18±0.03▲

3.3 Micro-CT扫描图像

Micro-CT图像显示模型组骨小梁数目缺失、变细、形态不规则、连续性下降、排列稀疏、间距变大，总体呈稀疏状骨微结构。给药组与对照组骨小梁数目增加、变粗、形态完整、连续性较好、排列紧密，间隙缩小，已接近空白组骨小梁微结构，这说明骨宝胶囊和钙尔奇D均能改善骨微结构。见图1。

图1 各组Micro-CT股骨远端扫描图像

3.4 Micro-CT三维重建

三维重建图像显示模型组骨小梁数量明显减少、骨小梁排列稀疏，骨髓腔内出现显著空虚，骨小梁网状结构缺失。给药组与对照组骨髓腔较为充实，骨小梁数量明显增加，骨小梁排列紧密，骨小梁间隙较小，骨小梁网状结构重现，可见骨宝胶囊和钙尔奇D均能显著改善骨微结构，其中给药组改善效果整体略优于对照组。见图2。

3.5 苏木精-伊红染色

模型组的骨小梁数目减少、厚度变薄、面积比低、连续性差、排列紊乱、骨质疏松特征显著。空白组松质骨丰富，骨小梁数目多、排列紧密、连续性好、骨组织结构完整、壁厚均匀。与模型组相比，给药组和对照组骨小梁结构均较为完整，纹理排列紧密。总体而言，给药组和对照组两组的骨小梁和松质骨的状态均优于模型组。见图3。

图3 各组HE染色结果（×100，标尺200 mm）

4 讨论

糖皮质激素（GC）临床上主要用于治疗过敏性疾病、自身免疫性疾病、器官移植后状态等。但长期应用容易导致糖皮质激素性骨质疏松（GIOP）的发生，应引起临床医生的重视［8］。近年来，GIOP受到广泛关注，但是如何规范防治仍是目前亟待解决的难题。中医学将GIOP归为“骨痿”“骨痹”“腰痛”范畴，把外源性药物GC归为“药邪”“壮火之品”。长期大量使用外源性GC必然会伤及人体。初期会助阳生热，日久则真阴损伤而表现为阴虚阳亢，虚火内动，灼伤阴精，精不足则化骨无源［9］；中期阴精耗损，阳随阴衰，阳气虚衰则筋骨痿软［10］；后期则阴阳俱衰，正气亏损，五脏六腑元气衰微，肾精化生无源，气血精髓无法濡养筋骨而致骨枯而痿［11］。

山东中医药大学附属医院内分泌专家张洪，师从全国名老中医程益春先生，作为学术继承人研究老年人病理、生理和临床特点，从肝肾入手，精选药物研制成骨宝胶囊。骨宝胶囊方中鹿角胶为君，味咸性温，能补肝肾、益精血、强筋骨；骨碎补为臣，入肝肾经，长于补肾壮骨，续筋止痛；白芍、当归为佐，其中白芍配甘草，酸甘化阴，既能制约壮火之品导致的阴阳失衡，又能缓急止痛。当归能养血补血，且兼能活血化瘀，通行血脉减轻肢体疼痛。诸药配伍，补益肝肾，强筋壮骨，对因骨质疏松而引起的疼痛症状改善明显。尽管骨宝胶囊已取得较好的临床效果［12］，但其防治GIOP的效果尚未被证实。为此本研究通过动物实验成功造出糖皮质激素性骨质疏松Wistar大鼠模型，并应用骨宝胶囊干预，同时与临床常用药物钙尔奇D相比较。

本次实验生化结果发现，给药组大鼠血生化指标中，血清钙水平有显著提高，血清磷、碱性磷酸酶则与空白组、模型组相比差异不明显。冯佳等［13］通过实验研究对比了去势、糖皮质激素、维甲酸诱导不同造模方式下对血清生化指数的影响，结果显示糖皮质激素造模方式与正常组对比，血清磷、碱性磷酸酶无显著差异，与本研究结果相一致。骨密度是诊断骨质疏松症的金标准，可反映骨骼的矿物质水平［14］。GIOP大鼠模型造模成功后，骨密度显著低于空白组。不同药物干预后，各组大鼠骨密度均有提高，证明骨宝胶囊和钙尔奇D可以有效地改善糖皮质激素性骨质疏松。

Micro-CT技术是一种敏感且可靠的定量定性分析技术，可用于分析骨骼骨矿含量及重塑骨骼微细结构［15］，本实验采用Micro-CT技术对大鼠股骨进行分析，研究发现与模型组比较，给药组显著升高了BV/TV、Tb.N，且Tb.Sp明显降低，骨小梁数量增多、排列结构整齐，骨质改善效果更佳。说明骨宝胶囊不仅可以提高GIOP大鼠的骨密度，还可以改善其骨微细结构，有效预防GIOP的发生。此外，HE染色中给药组也有良好表现，给药组骨小梁数量增加、密度增大，且具有连续性，反映出骨密度较高，对糖皮质激素性Wistar大鼠骨质疏松状况改善显著。

同时，本研究存在一定不足，各组样本量较小，对研究结果可能存在一定的影响；对骨密度、骨微结构、骨代谢角度研究较多，缺乏骨宝胶囊治疗GIOP靶点通路的深入探究。

综上，本研究成功建立糖皮质激素诱导的骨质疏松大鼠模型，骨宝胶囊对其进行干预后，从血清生化指标、骨密度相关参数、Micro-CT、三维重建和组织病理学染色多方面评估骨宝胶囊对大鼠骨质疏松的影响，相较以往临床试验而言，本研究通过体内实验发现骨宝胶囊能明显改善糖皮质激素诱导大鼠的骨质疏松，不仅能为GIOP相关动物实验研究提供参考，还为骨宝胶囊在临床中的应用提供数据支撑及理论依据。