胎盘绒毛跨膜蛋白CD81、Ang与复发性流产女性早孕期复发流产的关系

张晓英,董小敏,赵盼盼,于芳

(咸阳市中心医院,1.产科;2.检验科,陕西 咸阳 712000)

复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)指育龄女性连续发生两次及以上的自然流产[1]。临床中80%以上的自然流产均出现在妊娠12周前,且随流产次数的增加RSA再发流产风险会持续上升,因此需重视RSA女性早孕期复发流产的发生[2]。因胎盘绒毛正常的血管发育和血管新生是顺利妊娠的必要条件,故胎盘血管发育不良、内皮功能障碍与RSA的关系受到临床关注[3-4]。CD81为四次跨膜蛋白家族成员,已有研究[5]证实CD81表达上调参与子痫的发生发展,但其与RSA的关系则缺少报道。血管生成素(angiopoietin,Ang)/Tie2体系是胚胎期血管发生过程中具有重要作用的血管形成信号转导通路,其成员中Ang-1、Ang-2被证实与不孕、子痫、RSA等女性生殖相关疾病的发生、发展有关[6-7]。此外,早孕期血人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)反映绒毛活性,可促进月经黄体生长发育为妊娠黄体,刺激妊娠黄体产生雌激素,确保妊娠过程完整[8]。本研究旨在探讨胎盘绒毛跨膜蛋白CD81、Ang水平与RSA女性早孕期复发流产的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年6月至2022年6月于咸阳市中心医院妇产科因RSA行清宫术的126例患者为研究对象(RSA组);另选取同期94例正常早孕行人工流产术的患者为对照组。RSA组纳入标准：存在≥2次无诱因自然流产史,就诊时经超声确认胚胎停育[9];孕周<12周;拟行清宫术;20～40岁;夫妇双方染色体核型检测均正常;对研究知情同意。纳入标准：(1)经超声检查显示胚胎发育正常;(2)孕周<12周;(3)20～40岁;(4)因非计划妊娠要求终止妊娠,行人工流产术;(5)有≥1次正常妊娠史且无早产、死产等无不良孕产史;(6)对研究知情同意。排除标准：(1)生殖道感染或生殖器官畸形;(2)流产物染色体检查异常;(3)凝血异常;(4)合并恶性肿瘤;(5)合并免疫系统疾病;(6)合并糖尿病、甲状腺疾病等代谢性疾病;(7)有精神疾病史。本研究符合《赫尔辛基宣言》要求。

1.2 方法

1.2.1 资料收集与样本采集 由专人通过电子病历收集患者一般资料,包括年龄、孕周、孕次、体质量指数(BMI)。于手术当日留取两组患者胎盘绒毛组织标本,分为两份保存至无菌冻存管中,液氮保存。于手术当日采集两组患者血液标本2 mL,离心处理留取血清,保存至-20 ℃冰箱待用。

1.2.2 胎盘绒毛中CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA检测 RT-qPCR法检测。取胎盘绒毛组织,通过TRIzol法提取总RNA,再通过Prime Script RT reagent Kit试剂盒将总RNA反转录为cDNA,采用PCR仪进行实时荧光定量PCR反应,引物序列：(1)CD81：上游AGTACCTGCTCTTCGTCTTCA,下游GAACATCATGACAGCGCCCA;(2)Ang-1：上游TCCTGAGAGTACGACAGACCA,下游TCTCCGACTTCATGTTTTCCAC;(3)Ang-2：上游GATGGCAGCGTTGATTTTCA,下游ACATGCATCAAACCACCAGC。反应条件：(1)CD81：95 ℃预变性3 min,(94 ℃变性30 s,64 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s)30个循环,72 ℃延伸10 min;(2)Ang-1：94 ℃预变性3 min,(94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s)32个循环,72 ℃延伸10 min;(2)Ang-2：94 ℃预变性3 min,(94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s)30个循环,72 ℃延伸10 min。取PCR反应产物行2%琼脂糖凝胶电泳,以β-actin基因为内参,2-△△Ct法计算获得相应mRNA相对表达量。

1.2.3 CD81、Ang-1、Ang-2的蛋白检测 Western blot法检测。取胎盘绒毛组织加入蛋白酶裂解液提取蛋白,BCA法测量总蛋白浓度,计算50 μg蛋白上样量;取蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,2 h后转至PVDF膜,PVDF膜经5%脱脂奶粉封闭1 h,加入CD81、Ang-1、Ang-2一抗,4 ℃孵育过夜;PVDA膜经Tris-HCl缓冲盐溶液洗涤3次,10 min/次,加入封闭液稀释的HRP标记二抗(CD81稀释1∶50 000,Ang-1/Ang-2稀释1∶2 000),37 ℃摇床孵育2 h,封闭液洗膜,ECL显色照相并分析结果。

1.2.4 血清HCG检测 采用罗氏全自动电化学发光分析仪检测血清HCG水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较

两组患者的年龄、孕周、孕次及BMI比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 两组患者胎盘绒毛CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA表达水平比较

RSA组患者胎盘绒毛CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA表达水平及Ang-1/Ang-2 mRNA比值均高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者胎盘绒毛中CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA表达水平比较

2.3 两组患者胎盘绒毛CD81、Ang-1、Ang-2的蛋白表达及血清HCG水平比较

RSA组患者胎盘绒毛CD81、Ang-1、Ang-2的蛋白表达水平及Ang-1/Ang-2比值均高于对照组,血清HCG水平低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组患者胎盘绒毛CD81、Ang-1、Ang-2的蛋白表达及血清HCG比较

2.4 RSA胎盘绒毛CD81、Ang-1、Ang-2 mRNA及蛋白表达与血清HCG间的关系

Pearson相关性分析显示,RSA胎盘绒毛CD81 mRNA水平与Ang-1、Ang-2的mRNA水平正相关(r=0.421,0.465,0.472,P<0.05);RSA胎盘绒毛CD81蛋白表达量与Ang-1、Ang-2蛋白表达量正相关(r=0.413,0.451,0.463,P<0.05),胎盘绒毛CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA及蛋白表达量均与血清HCG水平无相关性(P>0.05)。

2.5 胎盘绒毛跨膜蛋白CD81、Ang和HCG表达对RSA女性早孕期复发流产的预测价值

CD81 mRNA、Ang-1/Ang-2mRNA、CD81 蛋白、Ang-1/Ang-2蛋白、HCG均可用于预测RSA女性早孕期复发流产(AUC=0.881,0.864,0.777,0.836,0.759)。见表4及图1。

表4 胎盘绒毛跨膜蛋白CD81、Ang和HCG表达预测RSA女性早孕期复发流产的ROC曲线分析

3 讨论

妊娠是一个受到精细调控的复杂生理过程,当胎盘血管发育不良、出现内皮功能障碍则可致胚胎血供不足,导致流产发生[10-11]。因此,与滋养细胞功能、血管生成相关的因子表达异常可能引起RSA患者早孕期复发流产,深入分析相关因子的调节机制对RSA早孕期流产防治具有重要临床意义。

CD81是外泌体的重要标志分子,参与信号转导、细胞融合及调控细胞迁移、血管内皮损伤等生理过程,对免疫细胞具有广泛调节作用[12]。目前已有研究[13]证实,CD81可通过抑制滋养细胞侵袭、促进血管内皮细胞激活等机制影响正常妊娠胎盘形成过程,参与子痫前期的发病,但其在RSA中的作用则仍需探究。此外,Ang-1、Ang-2为血管内皮细胞分泌的具有核糖核酸酶活性的促血管生成因子,二者均可与内皮特异性受体酪氨酸激酶Tie-2结合,在血管的重塑、成熟、出芽及生成分支中发挥着重要作用[14-15]。国内外均有研究[16-17]显示,血管生成素异常过表达可通过诱导妊娠期间子宫血管重塑、刺激滋养层侵袭等机制而影响正常妊娠过程。HCG水平则与滋养细胞的数量有关,被用于临床中判断宫内妊娠、异位妊娠、妊娠失败等异常妊娠状态。

本研究发现,与对照组相比,RSA组胎盘绒毛CD81、Ang-1、Ang-2 mRNA及蛋白表达水平和Ang-1/Ang-2 mRNA比值、Ang-1/Ang-2蛋白比值均升高,而血清HCG水平降低,提示胎盘绒毛CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA及蛋白异常表达参与RSA患者早孕期的复发流产,且患者处于低血清HCG水平的妊娠异常状态。相关性分析显示,RSA胎盘绒毛CD81、Ang-1、Ang-2 间的mRNA水平正相关,蛋白表达量间也呈正相关,且三者mRNA及蛋白表达量与血清HCG水平无关,提示胎盘绒毛CD81、Ang-1、Ang-2 高表达均会导致RSA患者早孕期复发流产,三者作用存在相关性且均与绒毛活性无关。余艳茹等[18]研究指出胎盘绒毛CD81异常高表达与RSA的发生有关,赵骏达等[19]研究显示绒毛组织Ang-1、Ang-2高度表达会导致RSA的发生,均支持本研究结论。由此可推测CD 81异常表达可能通过其对信号转导、细胞融合及调控细胞迁移的生理作用而降低滋养细胞侵袭浸润能力,影响血管生成过程和子宫螺旋动脉重塑,使胚胎浅着床而发生RSA。Ang-1、Ang-2的mRNA及蛋白异常表达使Ang-1/Ang-2比例失衡,可能通过促进血管内皮细胞和周细胞凋亡,引起血管内皮功能障碍,影响母-胎血液循环的建立,使胚胎缺血缺氧而发生RSA。ROC曲线显示,CD81 mRNA、Ang-1/Ang-2mRNA、CD81蛋白、Ang-1/Ang-2蛋白、HCG均可用于预测RSA女性早孕期复发流产,但单一评估指标敏感性或特异性不足,且临床实际中mRNA及蛋白检测推广存在一定难度,因此,后续临床研究可考虑寻找与胎盘绒毛组织CD81、Ang-1、Ang-2水平变化相关的血清指标用于预测评估,同时还可从改善胎盘绒毛组织CD81、Ang-1、Ang-2水平变化方面着手探究RSA防治方法。

综上,胎盘绒毛组织上调CD81、Ang-1、Ang-2的mRNA及蛋白表达参与RSA的发病,CD81、Ang-1、Ang-2间可能存在相互作用共同影响RSA发病,且三者与反映绒毛活性的HCG的相关机制无关,评估CD81、Ang-1、Ang-2、HCG表达水平在预测RSA女性早孕期复发流产方面具有一定诊断价值。