柴胡皂苷D调控miR-34a对胶质瘤细胞C6增殖与自噬的影响

刘晓熙,赵鹏伟,张静,于慧玲

(内蒙古医科大学基础医学院,内蒙古 呼和浩特 010020)

胶质瘤起源于神经胶质细胞,是颅内最为常见的原发性恶性肿瘤,调查[1]显示,胶质瘤发病率达到3.69/10万。目前临床上对于胶质瘤的治疗以手术、化疗为主,但多数患者临床疗效仍然较差,5年总生存率不超过35%[2]。故寻找新的有效治疗靶点和方案,对改善患者预后尤为重要。近年来,中医药在临床肿瘤治疗获得了一定成果,柴胡作为常用中药之一,其化学活性成份也受到明显关注。柴胡皂苷类是柴胡最具代表性的化学活性成分,含有多种单体,其中柴胡皂苷D药理活性最强,在抗肿瘤方面存在明显生物活性[3]。以往研究[4]显示,柴胡皂苷D可以抑制胶质瘤细胞体内外移植瘤生长、迁移和侵袭。但关于柴胡皂苷D调控胶质瘤细胞C6的具体机制尚处于探索中。miR-34a属于肿瘤抑制基因,能够调控多种因子表达继而影响肿瘤增殖、凋亡等[5]。有研究[6]显示,miR-34a可以抑制脑胶质瘤侵袭、转移。基于此,本研究拟进行细胞实验,观察柴胡皂苷D能否抑制胶质瘤细胞C6增殖和诱导其自噬,并验证柴胡皂苷D是否可通过调控miR-34a来影响胶质瘤细胞C6生物学行为。

1 材料与方法

1.1 主要材料

胶质瘤细胞C6(南京凯基生物科技发展有限公司),柴胡皂苷D(四川维克奇生物科技有限公司),7300全自动荧光定量PCR仪及实时荧光定量PCR试剂盒(美国ABI公司),总RNA提取Trizol试剂及Lipofectamine 2000转染试剂(美国Invitrogen公司),放射沉淀免疫试验(RIPA)裂解液(北京索莱宝科技有限公司),二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司),TBST液、Western印迹转膜缓冲液、Western印迹一抗稀释液及Western印迹二抗稀释液(上海雅酶生物医药科技有限公司),凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司),胎牛血清(美国GIBCO公司),总蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),辣根过氧化酶标记的兔抗鼠酶标二抗IgG(北京博奥生物技术有限公司),CCK-8试剂(上海尚宝生物科技有限公司),miR-34a及U6引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 DMEM培养基中加入10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素对胶质瘤细胞C6培养,培养箱环境：温度37 ℃,5% CO2。当细胞融合至70%～80%时,将其分为6组,分别予以终浓度为0、3、6、9、12、15 μmol/L的柴胡皂苷D处理48 h。

1.2.2 CCK-8实验 在96孔板中进行胶质瘤细胞C6接种,浓度为每孔6×103个细胞,之后在培养箱中孵育24 h,再加入CCK-8溶液10 μL/每孔,继续孵育2 h,去上清,加入DMSO 150 μL/孔,低速振荡5 min,通过酶标检测仪检测波长在450 nm处吸光度(OD值),计算不同浓度柴胡皂苷D处理下胶质瘤细胞C6的增殖率。每组设置6个复孔,独立重复实验3次。

1.2.3 蛋白免疫印迹法(Western blot) 各组胶质瘤细胞C6中加入RIPA裂解液,冰上孵育30 min,3 000 r/min离心,提取细胞总蛋白。BCA法检测蛋白浓度,加入一抗4 ℃孵育过夜,洗膜,二抗在37 ℃水溶箱中孵育1 h后,TBST液洗涤5 min×3次,加入显色液,通过凝胶成像系统检测蛋白条带表达情况,内参半定量分析胶质瘤细胞C6中自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的蛋白表达水平。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR) 采用Trizol试剂提取各组胶质瘤细胞C6总RNA,将RNA逆转录为cDNA,行荧光定量PCR扩增,反应体系为10 μL,样品管和内参(U6)管均设复管。预变性：95 ℃ 30 s,循环1次;反应条件：95 ℃ 1 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循环40次。反应结束后,根据仪器自带软件分析荧光信号,获取Ct值。采用2-△△CT法计算胶质瘤细胞C6中miR-34a mRNA表达水平。miR-34a上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGTGGCAGTGTCTTAG-3′,下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG-3′。

1.2.5 细胞转染 当胶质瘤细胞C6融合至70%～80%时,在6孔板中铺6×105个细胞,将细胞分成4组：对照组(Control组)、柴胡皂苷D组(Ssd组)、柴胡皂苷D+miR-34a阴性对照转染组(Ssd+miR-34a NC组)、miR-34a inhibitor转染+柴胡皂苷D组(Ssd+miR-34a inhibitor组)。对照组不予任何处理;Ssd组使用9 μmol/L柴胡皂苷D处理48 h;将miR-34a inhibitor、miR-34a NC分别转染至胶质瘤细胞C6,室温下静置20 min,分别加入到培养孔中,再继续孵育4 h。miR-34a inhibitor+Ssd组、Ssd+miR-34a NC组转染后,进行培养基更换,再用9 μmol/L柴胡皂苷D处理48 h。转染操作均按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行,并检测各组胶质瘤细胞C6中miR-34基因表达情况和自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 柴胡皂苷D对胶质瘤细胞C6增殖及自噬的影响

3、6、9、12、15 μmol/L组的柴胡皂苷D处理后的胶质瘤细胞C6增殖率均低于0 μmol/L组(P<0.05);Beclin1表达水平均高于0 μmol/L组(P<0.05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于0 μmol/L组(P<0.05)。见表1。

表1 柴胡皂苷D对胶质瘤细胞C6增殖及自噬的影响

2.2 柴胡皂苷D对胶质瘤细胞C6 miR-34a表达的影响

3、6、9、12、15 μmol/L组的柴胡皂苷D处理后的胶质瘤细胞C6 miR-34a表达水平均高于0 μmol/L组(P<0.05)。见表2。

表2 柴胡皂苷D对胶质瘤细胞C6miR-34a表达的影响

2.3 miR-34a转染对胶质瘤细胞C6增殖及自噬的影响

Ssd组、Ssd+miR-34a NC组、Ssd+miR-34a inhibitor组胶质瘤细胞C6增殖率均低于Control组;LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1表达水平均高于Control组(P<0.05),Ssd组、Ssd+miR-34a NC组胶质瘤细胞C6增殖率均低于Ssd+miR-34a inhibitor组;LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1表达水平均高于Ssd+miR-34a inhibitor组(P<0.05)。见图1-图2及表3。

表3 各组胶质瘤细胞C6自噬相关蛋白灰度值比较

3 讨论

胶质瘤恶性程度高,具有侵袭性强、治愈率低、复发率高等特点,发病率及致死率在中枢神经系统肿瘤中均处于第一位,对人类健康威胁大。随着中医药学的发展和在临床上的推广,通过中药来预防和治疗肿瘤也越发受到重视,探讨中医药在抗肿瘤方面的作用机制已成为医学研究热点。

柴胡皂苷是柴胡主要活性成分,其中柴胡皂苷D活性最显著。近年来研究[7]发现,柴胡皂苷D具有多种药理作用,包括保肝、抗肿瘤、抗癫痫等。时薛丽等[8]研究显示,柴胡皂苷D可以抑制胃癌细胞生长和迁移。党锋等[9]研究认为,柴胡皂苷D可通过诱导结直肠癌细胞自噬来抑制癌细胞增殖。自噬是一种分解代谢过程,细胞自噬与其衰老、凋亡均为非常重要的生物学现象,在生物生长和发育中起到了重要作用。报道指出,细胞自噬异常与恶性肿瘤发生和发展存在密切关联[10-12]。细胞自噬会受到自噬相关基因以及多种信号通路的调控,细胞收到相关信号或经过刺激后,能够启动III型磷脂酰肌醇激酶(VPS34)与Beclin1结合,形成吞噬泡后和自噬相关因子进行组装对接并形成自噬小体,待其成熟后再与溶酶体进行结合,最终降解细胞内物质,起到自噬作用。Beclin1可以调控自噬体膜合成,继而调控细胞自噬,故而Beclin1蛋白表达水平也能在一定程度上显示细胞自噬情况[13]。功能延伸为细胞自噬过程的重要环节,在功能延伸阶段,LC3-Ⅰ可转化为LC3-Ⅱ并存在于自噬体膜上,在各类自噬接头中起到重要作用,故而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可以反映细胞自噬情况[14]。以往关于柴胡皂苷D与癌细胞自噬的研究[9]显示,柴胡皂苷D会影响人结直肠癌细胞SW480中LC3相关蛋白水平,自噬抑制剂3-MA,可以对柴胡皂苷D诱导的结直肠癌细胞自噬进行负向调控。本研究探讨柴胡皂苷D对胶质瘤细胞C6增殖和自噬的影响,结果显示,经柴胡皂苷D处理48 h后,胶质瘤细胞C6增殖率明显受到抑制,且随着柴胡皂苷D浓度增加,增殖率逐渐下降,在浓度为9 μmol/L时增殖受限最为显著,故而选择将9 μmol/L作为后期工作浓度。自噬结果显示,经柴胡皂苷D处理后,自噬相关蛋白Beclin1表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显升高,提示柴胡皂苷D可以诱导胶质瘤细胞自噬,抑制其增殖。

目前有关柴胡皂苷D是通过何种途径影响胶质瘤细胞自噬的研究报道很少。有研究[15]发现,经小柴胡汤处理过的神经胶质细胞瘤中miR-34a表达水平随着小柴胡汤作用时间延长而升高。miR-34a是miR-34家族成员,可以调控多种靶基因(如抑癌基因p53)表达和信号通路(如Wnt、TGF-β/Smad3/4信号通路)活性,继而影响肿瘤细胞生物学行为[16]。过去研究[17]显示,miR-34a能够调控TGF-β/Smad4信号通路而促使细胞自噬发生,继而降低结肠癌细胞耐药性。在视网膜母细胞瘤和骨肉瘤的研究中也发现,miR-34a能够促进癌细胞自噬发生[18-19]。这些研究结果提示,miR-34a与癌细胞自噬关系密切,其表达水平升高促进癌细胞自噬发生。本次研究分析miR-34a转染对胶质瘤细胞C6增殖及自噬的影响,结果发现与Control组相比,Ssd组、Ssd+miR-34a NC组和Ssd+miR-34a inhibitor组胶质瘤细胞C6增殖率均明显下降,而自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显升高,且与Ssd+miR-34a inhibitor组相比,Ssd组、Ssd+miR-34a NC组对肿瘤增殖的抑制作用更为显著,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1表达水平更高,提示提示柴胡皂苷D可能是通过调控miR-34a实现来诱导胶质瘤细胞C6自噬。

综上,胶质瘤细胞C6实验从细胞水平验证了柴胡皂苷D可以抑制胶质瘤细胞C6增殖和诱导自噬发生,这种作用机制可能是通过调控miR-34a实现的。