ADCY6通过上皮-间质转化抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

周翼, 黄世贵,彭洪

(1.川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院肛肠外科,四川 南充 637000)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是胃肠道常见的恶性肿瘤,其早期症状并不明显[1-3],在我国发病率仅次于肺癌和胃癌[4]。CRC从癌前病变(腺瘤)到恶性病变的过程较长,是少数能通过筛查早期发现和治疗的恶性肿瘤之一[4]。腺苷酸环化酶亚型6(adenylyl cyclase isoform 6,ADCY6)基因是一种膜相关酶基因,可催化第二信使环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)形成[5-6],在正常甲状腺和脑组织中表达,且在功能亢进的甲状腺肿瘤中的表达明显高于正常甲状腺组织[7]。此外,ADCY6可通过控制乳腺癌免疫细胞浸润的关键细胞通路调控乳腺癌的恶性进展,其高表达将导致乳腺癌预后较差[8]。

上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是上皮细胞转化为间充质表型细胞的特定生物学过程[9],在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、肿瘤转移和多种纤维化疾病中发挥着重要作用[10],以细胞黏附分子(E-cadherin)表达下调、细胞角蛋白转化为波形蛋白细胞骨架和间充质细胞为形态特征[11],进而导致上皮细胞失去细胞极性,丧失与基底膜的连接等上皮表型,最终诱导迁移侵袭、抗凋亡和细胞外基质降解等间充质表型[9]。目前关于ADCY6与ENT、CRC的联系研究尚少,本研究拟探讨ADCY6与EMT、CRC的恶性生物学行为的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和转染

人正常结肠上皮细胞(fetal human colon,FHC)、人结肠癌细胞SW620、SW480、HCT116、人结肠腺癌细胞LS174T和人结肠癌细胞HT29细胞购自中国科学院细胞库。FHC和HT29细胞在洛斯维·帕克纪念研究所培养基(RPMI 1640,Gibco)中培养。SW620和SW480细胞在Leibovitz’s L-15培养基中(Gibco)中培养。HCT116细胞在添加10%胎牛血清的杜氏改良Eagle培养基(DMEM,HyClone;Cytiva)中培养。LS174T细胞在最低基本培养基(MEM,Gibco,)中培养。使用LV-ADCY6(Gene Pharma)感染CRC细胞以过表达ADCY6,用无义序列的慢病毒载体作为阴性对照。

1.2 生物信息学分析

使用UALCAN(http：//ualcan.path.uab.edu/cgi-bin/ualcan-res.pl)对ADCY6在多种恶性肿瘤及CRC中的表达进行分析。用UALCAN和HPA(https：//www.proteinatlas.org/)分析CRC中ADCY6蛋白的表达。UALCAN也被用于分析ADCY6表达水平与临床病理参数的关系。采用Kaplan-Meier Plotter(http：//kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=pancancer_rna seq)分析ADCY6表达与预后的关系。

1.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

用TRIzol试剂(TaKaRa,日本)从70 mg CRC组织和配对的相邻正常组织中提取总RNA。同前类似用TRIzol试剂提取CRC细胞的总RNA。使用PrimeScript RT 试剂(TaKaRa,日本)将提取的RNA逆转为cDNA。采用LightCycler系统(Roche)进行RT-qPCR。qPCR热循环条件如下：97 ℃ 2min,92 ℃ 15 s,63 ℃ 34 s,70 ℃ 30 s,循环40次。RT-qPCR引物设计如下：(1)ADCY6,正引物：5′-CAG CAG GGT AGT GTG TGC AG -3′,反引物：5′-TCT GCA TTT GAT TTT GGC CT-3′;(2)GAPDH,正引物：5′-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3′,反引物：5′-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3′。GAPDH作为内部对照,通过2-ΔΔCq计算相对RNA表达水平。

1.4 蛋白免疫印迹(Western blot)

用蛋白质提取缓冲液(RIPA裂解缓冲液)提取CRC细胞(1×106个)及 CRC和癌旁组织的总蛋白。10% SDS-PAGE凝胶分离总蛋白,5%脱脂奶粉在室温下孵育1 h。使用抗ADCY6 (1∶2 000,Abcam,USA)、抗vimentin波形蛋白 (1∶5 000,Abcam,USA)、抗e -cadherinE钙粘着蛋白 (1∶5 000,Abcam,USA)、抗n -cadherinN-钙粘蛋白 (1∶5 000,Abcam,USA)、抗ki -67 (1∶5 000,Abcam,USA)和抗GAPDH甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (1∶5 000,Abcam,USA)在4 ℃条件下过夜。然后,将膜与适当的二抗孵育。最后,用化学发光试剂(Hyperfilm ECL,USA)分析蛋白表达。

1.5 CCK-8测定细胞增殖情况

将细胞转染后接种到96孔板中,加入CCK-8检测试剂。记录每孔在450 nm处的吸光度以评估细胞增殖情况。

1.6 细胞侵袭和迁移试验

Transwell腔(Corning Costar,Cambridge,MA,USA)用于细胞迁移试验。用不含FBS的培养基将细胞转染并播种到上腔室(1×105个/孔)。在匹配的下室中加入500 μL含10%胎牛血清的高糖DMEM。孵育36 h后将上腔细胞移出,并用甲醇固定和0.1%结晶紫染色。显微镜随机选取每个样本的五个区域进行观测。在Transwell室的底膜涂上Matrigel溶液进行细胞侵袭试验。

1.7 肿瘤发生实验

5周龄雄性小鼠购自上海实验动物中心,将LV-ADCY6及对照慢病毒载体感染的HCT116细胞(2×105个)皮下注射在裸鼠的侧面。肿瘤体积计算公式：体积=(长度×宽度×高度)/2。注射后28 d处死小鼠,收集肿瘤进行分析。动物实验经南充市中心医院伦理委员会批准。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 ADCY6在CRC中表达下调,并与临床病理特征相关

ADCY6在多种恶性肿瘤中表达异常,且ADCY6 mRNA在CRC组织中的表达水平低于癌旁正常组织。此外,ADCY6在结肠癌组织中的蛋白表达水平也降低。Kaplan-Meier生存分析显示,ADCY6低表达的CRC患者总生存期(OS)缩短,但与高表达的患者比较差异无统计学意义(P>0.05)。ADCY6在结肠癌和直肠癌患者中的表达水平与年龄、肿瘤分期和淋巴结转移密切相关。患者年龄越大,ADCY6 mRNA表达水平越低;与正常组织比较,ADCY6的mRNA表达水平在1、2、3和4期患者中均降低。有淋巴结转移的CRC患者ADCY6表达水平低于无淋巴结转移的CRC患者。见图1及图2。

2.2 ADCY6过表达可抑制CRC的增殖

FHC细胞中ADCY6的表达水平高于CRC细胞(SW620、SW480、HCT116、LS174T和HT29),SW620和HCT116细胞中ADCY6的表达处于较低水平。转染LV-ADCY6后,SW620和HCT116细胞中ADCY6 mRNA和蛋白的表达水平均上升。CCK-8检测结果显示,与阴性对照组细胞相比,过表达ADCY6后可下调SW620和HCT116细胞的增殖水平。见图3。

2.3 ADCY6过表达抑制CRC的迁移和侵袭能力

与对照组相比,ADCY6过表达组SW620和HCT116细胞的迁移能力降低,证实ADCY6表达上调可抑制SW620和HCT116细胞的迁移能力。此外,过表达ADCY6还可抑制SW620和HCT116细胞的侵袭能力。见图4。

2.4 ADCY6过表达抑制CRC肿瘤生长

过表达ADCY6抑制HCT116细胞的肿瘤生长,裸鼠皮下移植瘤的体积和重量均降低。见图5。

2.5 ADCY6过表达抑制CRC细胞的EMT

ADCY6对CRC细胞的细胞迁移和侵袭能力均有抑制作用。ADCY6上调可导致N-cadherin、vimentin和Ki-67蛋白表达降低,而E-cadherin蛋白在SW620和HCT116细胞中的表达增加。见图6。

3 讨论

全球每年约有120万患者被诊断为CRC,超过60万患者直接或间接死于CRC[12-13]。虽然基因突变是结肠直肠癌发生的一个危险因素,但大多数结肠直肠癌都是散发的[14]。目前,外科手术、新辅助放疗(直肠癌患者)和辅助化疗(III期、IV期或高危II期结肠癌患者)是CRC最主要的治疗策略[15],I期患者的5年生存率>90%,IV期患者的5年生存率略高于10%[16]。内窥镜检查或血液筛查可降低CRC的发病率和死亡率,但由于大规模操作难度较高,大多数国家尚未实施有组织的筛查[17]。因此,继续探索和揭示CRC发生发展的分子机制至关重要,为其诊断提供更为便捷、高效的方式。

ADCY6是膜结合腺苷环化酶家族的一员,可将三磷酸腺苷转化为cAMP和焦磷酸[18-19],可为肿瘤细胞生长提供大量能量和生长物质。既往研究[20]指出,ADCY6在口腔舌鳞癌中表达水平降低,可通过抑制Hippo信号通路降低口腔舌鳞癌的恶性生物学行为。但在非小细胞肺癌中,ADCY6的表达明显增高,miR-542-5p通过下调ADCY6的表达显著抑制非小细胞肺癌的生长和血管生成[21]。本研究表明,ADCY6在CRC中低表达,且ADCY6低表达的患者OS略低,但差异无统计学意义,这可能是由于样本量较小,后续仍需加大样本以进一步验证ADCY6与CRC预后的剂量依赖性。此外,在结肠癌和直肠癌患者中,ADCY6的表达与年龄、肿瘤分期和淋巴结转移密切相关。本研究还显示,过表达ADCY6可抑制CRC细胞的体外和体内增殖能力,高表达ADCY6降低CRC细胞的迁移和侵袭能力,表明ADCY6在CRC中扮演着抑癌基因的角色。

EMT是指上皮细胞在特定生理或病理条件下向间充质细胞转化的过程,其特征是上皮细胞失去典型的细胞间连接结构,并且细胞骨架重组,由多边形变为梭形[22]。EMT发生后可出现细胞分离,上皮细胞中的的E-cadherin蛋白等上皮标记物表达减少,功能丧失[23]。同时N-cadherin、vimentin和Ki67蛋白等基质细胞标志物表达增强,提高细胞的运动能力,抑制细胞的凋亡[24],从而促进肿瘤细胞的增殖,迁移和侵袭。EMT的发生常伴随着结肠癌细胞迁移和侵袭能力的增强[25],CRC恶性进展与EMT转录程序的调控激活密切相关[26]。本研究发现,过表达ADCY6可导致N-cadherin、vimentin和Ki-67蛋白表达显著降低,E-cadherin蛋白表达则明显增高,证实ADCY6可抑制EMT过程, ADCY6可能通过调控EMT抑制CRC的恶性生物学行为。

综上,ADCY6可通过调节EMT抑制CRC细胞的增殖、侵袭和迁移,从而发挥抑癌作用。