lncRNA UCA1靶向miR-145调控癫痫细胞炎症反应

樊丽霞

福州市第二医院神经内科，福州 350004

癫痫是一种脑部慢性疾病，全球约超过5000 万人受其困扰，严重影响了患者及其家庭的生活质量。抗癫痫发作药物主要是缓解患者的症状，但约30%的癫痫患者对抗癫痫药物有耐药性[1-2]。癫痫的发生是一个复杂的多因素过程，其发病机制仍不十分清楚，对癫痫发生机制的深入探讨对开发新的癫痫治疗策略具有重要意义。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200nt、缺乏编码蛋白能力的非编码RNA。膀胱癌相关1（UCA1）的长非编码RNA（lncRNA）是与炎症相关的lncRNA 之一，以往的研究表明UCA1 对癫痫大鼠存在动态调节效应[3]。有发现在体外抑制miR-145 可防止突触收缩并降低体内癫痫发作的严重程度[4]。生物信息学预测发现UCA1 和miR-145 可能存在靶向关系，但UCA1 和miR-145 在癫痫细胞炎症反应中是否存在靶向调控关系尚未见报道。因此，本研究将探究沉默和过表达UCA1 对癫痫细胞炎症调控及其与miR-145 的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 CTX-TNA 星形胶质细胞购自LMAI Bio 公司；高糖DMEM 培养基购自Hyclone、OPTI-MEM培养液、胎牛血清购自GIBCO 公司；Lipo2000 购自Invitrogen 公司；miR-145 模拟物、miR-145 抑制剂、cDNA 反转录试剂盒、pcDNA3.1 质粒、psiCHECK质粒、Trizol 试剂购自赛默飞科技有限公司；Dual-Luciferase 报告基因检测系统检测试剂盒Promega 公司、荧光定量试剂盒购自百欧泰；shUCA1、CCK8试剂盒购自abcam 公司；UCA1 全序列合成及引物合成由上海生工完成；青霉素链霉素（双抗）、胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 CTX-TNA2 星形胶质细胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培养液（含D-葡萄糖4.5 g/L、碳酸氢钠3.4 g/L、L-谷氨酰胺584 mg/L、青霉素75 mg/L、链霉素50 mg/L），于含有5% CO2的CO2孵育箱中，在37℃、95%湿度条件下培养，并用10 ng IL-1β 持续处理24 h。显微镜下观察细胞为贴壁细胞。

1.2.2 细胞转染 取对数生长期细胞接种于6 孔板，培养24 h 后按照操作手册采用lipo2000 将shUCA1、pcDNA3.1-UCA1 重组质粒、pcDNA3.1 空质粒转染入CTX-TNA 星形胶质细胞，并根据实验需要采用lipo2000 分别或同时转染shUCA1、miR-145 inhibitor，转染48h 后进行实验。

1.2.3 CCK8 检测细胞活性 将CTX-TNA 细胞（4×103个细胞/孔）铺在96 孔板中生长24 h。除去培养基，并将CCK-8 溶液加入培养基中，使用酶标仪在490 nm 处测量光密度（OD）值，OD 值越大，细胞活力越强。

1.2.4 荧光素酶报告实验 通过starBase 数据库的miRNA-lncRNA interactions 模块预测分析UCA1与miR-145 的结合位点。基因合成UCA1 中含有miR-145 结合位点的片段，并将该片段插入pmirGLO载体。将CTX-TNA 细胞用上述构建体转染，并与模拟NC 或miR-145 模拟物共转染。在37℃下温育48 h 后，收获细胞，根据Dual-Luciferase 报告基因检测系统检测试剂盒测定荧光强度。

1.2.5 RT-qPCR RT-qPCR 反应在7900HT 快速实时PCR 系统上操作，实时PCR 系统测量各组miR-145的表达水平，以GAPDH 内参，引物序列见表1。各组mRNA 的相对表达量通过2-ΔΔCt 进行分析。

表1 RT-qPCR引物列表

1.2.6 ELISA 实验 收集各组细胞上清液，按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，检测细胞上清液中炎症因子IL-2、IL-6、TNF-α 的水平。绘制标准曲线，计算样本浓度。

1.3 统计学分析 应用SPSS19.0 对数据进行统计学分析。计量资料两两比较采用t检验，多组间比较采用One-Way ANONA 分析，数据以表示，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UCA1 对CTX-TNA2 星形胶质细胞炎症因子的影响 与对照组、过表达空载体组、干扰空载体组、sh-UCA1 干扰组相比，pcDNA3.1-UCA1 过表达组IL-2、IL-6、TNF-α 均显著降低（均P＜0.01）；与对照组、过表达空载体组、pcDNA3.1-UCA1 过表达组、干扰空载体组相比，sh-UCA1 干扰组IL-2、IL-6、TNF-α 均显著增高（均P＜0.01）。见表2。

表2 各组炎症因子的表达

2.2 UCA1 对CTX-TNA2 星形胶质细胞miR-145 表达的影响 UCA1 过表达可显著降低CTX-TNA2 星形胶质细胞miR-145 表达水平（P＜0.01）。下调UCA1 表达可显著增加CTX-TNA2 星形胶质细胞miR-145 表达（P＜0.01），表明UCA1 可影响CTXTNA2 星形胶质细胞miR-145 表达。见图1。

图1 UCA1对CTX-TNA星形胶质细胞miR-145表达的影响

2.3 UCA1 靶向结合miR-145 UCA1 基因序列上存在miR-145 的结合位点，为研究miR-145 是否是lncRNA UCA1 的功能性直接靶标，进行了双荧光素酶报告分析。数据分析结果表明，同时转染miR-145和野生型UCA1 质粒（UCA1WT）可显著减弱荧光素酶活性（P＜0.01），UCA1 结合位点突变后，同时转染miR-145 和突变型UCA1 质粒（UCA1 MUT）荧光素酶活性升高。表明UCA1 和miR-145 间存在靶向调控关系，见图2。

图2 UCA1靶向结合miR-145

2.4 沉默UCA1 对CTX-TNA2 星形胶质细胞炎症因子的影响 与对照组相比，shUCA1 组CTX-TNA2 星形胶质细胞炎症因子IL-2、IL-6、TNF-α 均显著升高（P＜0.01）；与对照组相比，sh-UCA1+miR-145 抑制剂组TNF-α 无明显统计学改变（P＞0.05），sh-UCA1+miR-145 抑制剂组IL-6、IL-2 显著降低（P＜ 0.01）；与sh-UCA1 组相比，sh-UCA1+miR-145 抑制剂组IL-2、IL-6、TNF-α 明显降低（P＜ 0.01）。见表3。

表3 各组炎症因子的表达

3 讨论

癫痫一直位列世界卫生组织（World Health Organization，WHO）重点防治的五大神经精神疾病之一。据WHO2018 年发布的实况报道，估计我国有高达1000 万以上的人群受累。尽管有大量抗癫痫发作药物，但约30%的癫痫患者对抗癫痫药物有耐药性[1-2]。同时，许多抗癫痫药物都有副作用，如头晕、嗜睡和思维迟钝。此外，现有药物可以预防癫痫发作，但不能预防癫痫发生[5]。因此，寻找新的有效疗法也是当前癫痫领域研究关注的热点。

尽管近年来在癫痫发病机制方面取得了一些进展，但由于癫痫的复杂性，其发病机制仍不十分清楚，也是癫痫极难治愈的主要原因[6]。因此，对癫痫发生机制的深入认识，对开发新的癫痫治疗方法具有重要意义。

近年来，越来越多的证据表明，炎症在癫痫发病机制中起着重要作用[7]。炎症反应失调可能导致神经连接异常和神经网络兴奋过度，促进癫痫的发生和发展[8]。目前研究认为IL-1、IL-6 及肿瘤坏死因子α（TNF-α）等细胞因子与癫痫有关。然而，癫痫的炎症调控机制尚不完全清楚。

许多研究报告提示星形胶质细胞功能障碍促进癫痫的发展和进展，星形胶质细胞在癫痫的发病机制中起着关键作用[9]。基于文献报道及本研究团队既往的研究，用IL-1β 处理的CTX-TNA2 细胞可以作为研究癫痫的体外模型。本研究证明了lncRNAUCA1 通过调节miR-145 调控癫痫细胞炎症反应，这为制定癫痫策略治疗提供了新的靶点。

据报道lncRNA 的异常表达与癫痫有关，lncRNAUCA1 可抑制癫痫[10]。本研究发现lncRNAUCA1可抑制癫痫细胞模型的炎症反应。由于炎症可能促进癫痫发生[11]，lncRNAUCA1 可以通过抑制炎症抑制癫痫，但其抑制机制尚不十分清楚，有待进一步研究。

众所周知，miRNA 作为lncRNA 的介导物，调节基因表达，已成为癫痫病因和发展的关键因素[12]。有学者发现在体外抑制miR-145 可防止突触收缩并降低体内癫痫发作的严重程度[13]。研究还发现，miR-145 能够调节多种疾病的信号通路[14]。本研究发现在癫痫细胞模型中，过表达UCA1 可明显抑制miR-145 表达（P＜0.001），沉默UCA1 可显著促进miR-145 表达（P＜0.001），过表达UCA1 可抑制癫痫细胞炎症因子IL-2、IL-6、TNF-α 的表达；证明过表达UCA1 可靶向miR-145 调节癫痫细胞的炎症反应，miR-145 为lncRNAUCA1 的直接靶点，进而影响炎症。

总之，对lncRNA 及其下游分子机制的研究有助于阐明癫痫的发病机制。本研究证明了lncRNAUCA1通过调控miR-145 来抑制癫痫的炎症反应。本研究中的所有数据均来自体外试验，但未来研究计划将在体内进行进一步的研究，以验证癫痫的调节机制，为癫痫患者的治疗策略提供新的靶点。