VEGF/VEGFR2促进人胃癌组织微血管生成的研究

刘一凡,林佳静,林 源,邓 红,王欣怡,徐传皓,王凯博,韩 梅,刘荣清

VEGF为促进血管新生的因子,对内皮细胞的间接分裂和增生有促进作用,可改善血管通透性,具有推进内皮细胞转移的作用[1]。且VEGF-VEGFR信号传导通路是诱导血管生成的最关键途径[2],在VEGF的受体中,VEGFR-2(KDR)是主要受体,其表达水平与血管内皮细胞的更新速率呈正相关。有研究表明,KDR过度表达会导致胃癌患者病情恶化[3]。本文比较了胃癌组织与癌旁组织之间、有无转移胃癌组织之间以及不同浸润深度胃癌组织之间血管生成的差别,分析 VEGF、VEGFR-2表达情况对胃癌血管生成的影响,为研究胃癌血管生成机制和胃癌治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料:收集在宁夏医科大学总医院于2007年9月至2009年9月间接受手术治疗的胃腺癌49例患者的胃癌组织样本和癌旁组织样本,其中男性39例,女性10例,年龄38～78岁。所有患者已知情、同意,且术前均未进行过放疗、化疗。将49例病例按TNM分期分为T1T2组(8例)、T3组(20例)和T4组(21例);按有无转移分为有转移40例,无转移9例。手术中取出的癌症标本和距离手术残端仅1 cm的癌旁组织被分成两部分,其中一部分立即在液氮中冷冻,然后在-80 ℃的冰箱中保存用于Western-blot实验;另一份固定在10%福尔马林中并嵌入常规石蜡中用于免疫组织化学检测。

1.2 主要试剂:采用武汉博士德公司制作的抗CD34兔多克隆抗体;凯基生物公司制作的全蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒;中山金桥公司生产的山羊抗兔二步法免疫组化检测试剂、山羊超敏二步法免疫组化检测试剂;Santa公司制作的VEGF抗体、哈佛大学医学院雷和田教授馈赠的VEGFR-2抗体。

1.3 CD34染色检测胃癌组织的微血管密度:胃癌组织用石蜡包埋后切片,将切片冲洗并干燥、脱蜡、修复抗原、滴加10%驴血清在室温下封闭15 min,然后加抗CD34兔多克隆抗体(1∶100稀释)过夜,二抗为辣根酶标记羊抗兔多聚体,孵育30 min后用PBS洗净,滴加DAB显色液显色。在显微镜下找到染为棕色的内皮细胞分布最多的视野,在200×视野内的任何5个未重叠的视野中计数阳性血管的数目,用单位面积(×200)内CD34阳性血管的数量作为微血管密度(MVD)。

1.4 免疫组织化学法检测胃癌组织中VEGF:取石蜡包埋的胃癌组织切片,制片步骤与上述步骤相同。加兔抗VEGF多克隆一抗抗体(1∶50稀释)过夜,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多聚体的二抗在室温孵育30 min,PBS洗涤,并通过滴加DAB显色液显色。显微镜下VEGF定位于胞浆中,呈棕黄色片状或者颗粒状。每张切片不少于5个随机选择的视野,用400倍光学显微镜观察拍摄。用Image pro plus 6.0版执行图像分析,以平均光密度来显示相对表达量,平均光密度值(AOD)=总体光密度值/阳性面积。

1.5 Western-blot法检测胃癌组织中VEGF、VEGFR-2水平:根据全蛋白提取试剂盒的说明提取组织蛋白,并使用BCA试剂盒测定蛋白浓度,调整最终浓度为10 μg/μL。配胶后,向每个孔中添加20 μL蛋白,电泳后转移到PVDF膜上,并在室温下用3%牛血清白蛋白封闭90 min。分别加入1∶100稀释的兔VEGF多克隆抗体、1∶500稀释的兔VEGFR-2多克隆抗体、1∶1 000稀释的兔β-actin单克隆抗体,于4 ℃过夜,清洗膜后,分别添加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多聚体,在室温下孵育90 min并使用DAB试剂盒显色5 min终止反应。将膜放于凝胶成像仪中进行扫描。测出VEGF、VEGFR-2和内参β-actin的表达强度,按下面公式计算相对表达量,蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参灰度值。

2 结果

2.1 不同阶段胃癌组织中微血管密度比较:CD34位于血管内皮细胞的细胞质或细胞膜中,其阳性显示为棕黄色,见图1(封3)。胃癌组织中MVD(11.20±3.66)高于癌旁胃组织(2.87±2.63)(P﹤0.05);有转移的胃癌组织MVD(11.94±3.28)高于无转移的胃癌组织(6.96±2.24)(P﹤0.05);胃癌T4期中的MVD(13.34±3.74)高于胃癌T1T2期(7.93±3.10)(P﹤0.05);胃癌T4期中的MVD高于胃癌T3期(9.83±2.00)(P﹤0.05)。

2.2 不同阶段胃癌组织VEGF水平比较:采用免疫组化法检测VEGF的表达量,胃癌组织(0.35±0.03)高于癌旁组织(0.04±0.02)(P﹤0.05),胃癌组织间差异无统计学意义(P>0.05),见图2(封3)。Western-blot结果显示,胃癌组织中VEGF相对表达量(0.35±0.12)高于癌旁组织(0.17±0.09)(P﹤0.05),在有转移的胃癌组织中VEGF相对表达量(0.37±0.13)高于无转移的胃癌组织(0.25±0.04)(P﹤0.05);T4期胃癌组织中VEGF相对表达量(0.40±0.10)高于T1T2期(0.10±0.03)(P﹤0.05);T4期胃癌组织中的VEGF相对表达量高于T3期(0.33±0.14)(P﹤0.05)。

2.3 不同阶段胃癌组织中VEGFR-2的比较:VEGFR-2的相对表达量胃癌组织(0.15±0.06)高于癌旁胃组织(0.13±0.04)(P﹤0.05),有转移的胃癌组织(0.16±0.06)高于无转移的胃癌组织(0.11±0.02)(P﹤0.05)。T1T2期与T3期,T1T2期与T4期,T3期与T4期比较差异均无统计学意义(P﹥0.05)。

2.4 胃癌组织中VEGF、VEGFR-2表达与微血管密度的相关性分析:胃癌组织中,VEGF与微血管密度呈正相关(r= 0.510,P<0.05);VEGFR-2与微血管密度呈正相关(r= 0.297,P<0.05)。

3 讨论

胃癌是胃肠道的常见恶性肿瘤之一[4]。血管生成在保持正常人体生理状态中起着至关重要的作用,因为血管能够将营养物质携带到组织和器官,并清除分解代谢产物[5]。然而,不受控制的血管生长可以参与多种病理过程,如肿瘤浸润和转移[6]。检验组织中血管形成的重要指标之一为MVD。本研究中,胃癌组织的MVD显著高于癌旁胃组织,而转移和浸润较深的胃癌组织的MVD明显升高。提示微血管密度与胃癌转移和浸润有关,较高的MVD可能促进胃癌的进展,促进浸润转移。

VEGF分子量15～45 kDA对血管内皮细胞起直接作用,是新生血管生理和病理过程中内皮细胞形成的关键生长因子。VEGF家族成员主要通过3个跨膜酪氨酸激酶受体家族发挥生物学功能,包括VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3[7]。VEGF与VEGFR通过旁分泌方式共同调节内皮细胞发育,并参与调节血管生成,发挥生物学效应[8]。近年来的一些研究证实,VEGF与其受体(VEGFR-2)通过多种机制增加癌症转移,包括刺激肿瘤血管生成,在肿瘤中形成紊乱的原始血管,以及通过重塑肿瘤血管增进癌细胞和血管内皮细胞之间的相互作用改变宿主大环境并促进癌细胞转移扩散等[9]。本文通过免疫组化和Western-blot检测均证实胃癌组织中VEGF呈现高表达,且VEGF与MVD呈正相关。同时,在对VEGFR-2的检测中也发现,胃癌组织中VEGFR-2也呈高表达,且VEGFR-2与MVD也呈正相关。提示在胃癌中,VEGF结合VEGFR-2可增加肿瘤微血管形成,并通过微血管给肿瘤组织输送营养,进而促进胃癌的进展、浸润转移。

综上所述,本文证实了胃癌微血管生成促进其转移和浸润,且VEGF/VEGFR-2对胃癌血管的生成有促进作用。