乳制品中γ-氨基丁酸含量的测定

陈盛

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是中枢神经系统中非常重要的活性物质，具有多种生理功能。γ-氨基丁酸是中枢神经系统的一种抑制性神经递质，在调节神经元兴奋度上起着重要作用，具有安神、降血压、改善肝肾功能、促进睡眠、缓解焦虑、抗抑郁等多种生理功效。

现有的食品中，γ-氨基丁酸检测的手段主要有酶法、比色法、液相色谱法及液相色谱-串联质谱法。其中，高效液相色谱法因高准确度、高灵敏度等优势应用较为广泛，但是由于γ-氨基丁酸对紫外、可见光不灵敏，必须被衍生化后加上发光基团后才能被高效液相色谱的紫外或荧光检测器检测到，其衍生产物并不稳定，对检测结果影响较大。

本研究建立了使用氨基酸分析仪检测乳与乳制品中γ-氨基丁酸含量的方法，其利用γ-氨基丁酸水溶性的特点，经盐酸水解后，经离子交换柱层析分离，与茚三酮溶液产生显色反应，用标准曲线法定量检测出其含量。整个操作过程快速简单，不需要额外衍生，提取效率高，适合乳与乳制品中γ-氨基丁酸含量的测定。

1.实验部分

1.1试剂和材料

1.1.1试剂

盐酸（HCl）：浓度≥36%，优级纯。

氢氧化钠（NaOH）：优级纯。

柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）：优级纯。

苯酚（C6H5OH）：优级纯。

柠檬酸三钠（二水）：优级纯。

硼酸：优级纯。

醋酸钠：优级纯。

醋酸钾：优级纯。

冰乙酸：优级纯。

茚三酮：优级纯。

1.1.2试剂配制

盐酸溶液（6mol/L）：取500mL 盐酸加水稀释至1000mL，混匀。

NaoH溶液：称取50gNaoH，溶于50mL 水中，用水定容至100mL后混匀备用。

柠檬酸钠缓冲溶液：称取19.6g柠檬酸钠加水溶解，后加入16.5mL盐酸，用水定容至1000mL，用盐酸溶液调节pH至2.2。

1.1.3氨基酸分析仪上所使用溶液配制

缓冲液Buffer A：取11.8g柠檬酸三钠+6.0g柠檬酸+0.5g苯酚溶于水中，加入浓盐酸6.5mL、甲醇65mL，混匀后用HCl溶液和NaOH溶液调pH值到3.45，最后定容至1L，过膜待用（0.45μm）。

缓冲液Buffer B：取19.6g柠檬酸三钠+5.0g硼酸+3.1g氢氧化钠溶于水中，混匀后用HCl溶液和NaOH溶液调pH值到10.85，最后定容至1L，过膜待用（0.45μm）。

4mol钾/钠醋酸缓冲液（pH 5.51）：取272.0g三水醋酸钠、196.0g醋酸钾，加入500mL水及200mL乙酸溶解。混合均匀，用乙酸调pH值到5.51后，定容至1L，过膜待用（0.45μm）。

茚三酮衍生溶液：取20g茚三酮+600mL、甲醇+2g苯酚搅拌溶解；加入400mL 4mol钾/钠醋酸缓冲液混合均匀，定容至1L储备液待用；最后向溶液中加入还原剂，充入氮气2分钟。

清洗溶液：600mL异丙醇与400mL去离子水混合。

1.2標准溶液配制

标准品 ：γ-氨基丁酸标准品，天津埃尔塔公司。

标准储备液：分别称取 0.0100g 标准品（4.3）置于10.0mL 棕色容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，标准储备液浓度为1.0mg/mL，4ºC冰箱中保存，有效期3个月。

标准工作液：分别取各标准储备液（4.4.1）1.0mL至10.0mL 棕色容量瓶中，用水定容至刻度，此标准工作液浓度为100μg/mL，4ºC冰箱中保存，有效期1个月。

1.3仪器和设备

氨基酸分析仪：赛卡姆（北京）科学仪器有限公司。电子天平：BP211D，Sartorius公司。

漩涡混合器——TALBOYS（上海安谱科学仪器有限公司）；氮吹仪（上海安谱科学仪器有限公司）；鼓风干燥箱（上海安谱科学仪器有限公司）。

1.4分析步骤

1.4.1样品前处理

称取试样1g（精确到0.0001g）置于水解瓶中，加入10mL6mol/L 盐酸溶液（1.2.1），并加入3-4滴苯酚。将水解瓶放入冰箱冷冻室内，冷冻约3min-5min后，抽真空后充入氮气（重复抽真空-充入氮气3次），在充氮气状态下拧紧螺丝盖。将水解瓶置于110℃±1℃的鼓风干燥箱内，水解22h后，取出后冷却至室温。

打开水解瓶，将水解液过滤至50mL离心管中。准确吸取1.0mL滤液移入15mL玻璃试管中，用试氮吹仪在40℃-50℃水浴中下吹干。

加入1.0mL pH2.2柠檬酸钠缓冲溶液到15mL试管内溶解残渣，振荡混匀后，吸取溶液过膜待用（0.22μm）。

1.5测定条件

1.5.1 氨基酸分析仪条件

色谱柱： LCA K06/Na柱。

流动相：柠檬酸钠A=0.12N，pH 3.45；B=0.2N，pH10.85。

流速：洗脱泵 0.45mL/min+衍生泵 0.25mL/min。

柱温：58℃-70℃梯度控温。

进样体积：50μL。

检测波长：440nm及570nm。

压力：30bar-40bar 。

1.6标准曲线的制作

准确移取适量标准工作液，用水定容，再得到浓度分别为：50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L的标准溶液。将标准系列溶液注入氨基酸分析仪，得到各组分的色谱图和峰面积。以目标化合物的浓度为横坐标，以目标化合物的峰面积为纵坐标，绘制工作曲线。

2.结果与分析

2.1线性关系

在浓度为50-2000μg/L，γ-氨基丁酸的峰面积与其浓度呈良好的线性关系，线性方程 y=0.8701x+2.1092，R2=1。具体见表1、图1。

2.2仪器精密度

配制浓度为1μg/mL的γ-氨基丁酸标准工作溶液，连续进样6次，其峰面积相对标准偏差为0.88%。其结果见表2、图2。

2.3 检出限和定量限

根据γ-氨基丁酸标准溶液的峰面积计算，当信噪比（S/N）为3时，测得仪器的检出浓度为50μg/L，得到方法的检测限为0.5mg/kg；方法的定量限则为1.5mg/kg。

2.4回收率、精密度及空白试验

以纯牛奶及奶酪为空白样品，分别在样品中添加γ-氨基丁酸标准溶液进行回收试验，添加浓度分别为50、100、200mg/kg， 每个浓度3个平行。结果见表3。

3.小结与讨论

本文实验结果表明，氨基酸分析仪可以用于乳与乳制品中γ-氨基丁酸含量的测定。该方法比高效液相色谱法减少了手动衍生的步骤，可直接进行测定，操作简单，节省时间，同时衍生产物较高效液相色谱法稳定。用氨基酸分析仪测量乳及乳制品中γ-氨基丁酸含量的方法简单快速，在浓度为50-2000μg/L，γ-氨基丁酸的峰面积与其浓度呈良好的线性关系。该方法丰富了乳及乳制品中γ-氨基丁酸含量的测定方法，可为研究乳及乳制品中γ-氨基丁酸含量提供技术参考。