家禽基因编辑相关技术研究进展及应用

2024-01-25冉明霞郑基坛刘兴廷左二伟陆阳清

中国畜禽种业 2023年12期

冉明霞，郑基坛,，刘兴廷，谢龙，左二伟*，陆阳清*

（1.广西大学动物科学技术学院动物繁殖研究所，广西南宁 530004；2.中国农业科学院深圳农业基因组研究所，广东深圳 518000）

我国是一个农业大国，家禽养殖产业是我国农业的重要组成部分，改革开放以来，尤其是21世纪以来，我国家禽产业发展迅猛，快速规模化、产业化。截至2022 年，我国禽肉产量达到2443 万t，位居世界第二，成为我国仅次于猪肉的第二大消费肉类，全国禽蛋产量达到3456 万t，位居世界第一[1]。家禽产业为我国经济的高速增长做出了卓越的贡献，在满足广大城乡居民生活需求、壮大乡村经济实力、优化农村产业结构、促进农民增收等方面均发挥了重要作用[2]。但在过去几十年的发展中，由于长期以来局限于追求畜禽产品产量增长，缺乏对畜禽种质资源重要性认识，普遍存在 “重引进、轻培育，重杂交、轻保护” 现象，育种技术研究和应用相对落后，自主培育的产业主导品种少，生产效率及单产水平较低，与国际先进水平差距较大。以蛋鸡为例，我国蛋鸡产蛋期的产蛋量为15～17 kg，料蛋比为2.3～2.7∶1，死淘率为10%～20%。而美国、荷兰等养禽发达国家这3 个指标分别为18～20kg、2～2.3∶1、3%～6%[3-5]。据联合国粮食及农业组织（FAO）估计，2050 年世界人口将达到97 亿，对动物性食品的需求将增长70%，世界农作物和动物总产量需要增加60%才能满足需求[6,7]。我国人口也将持续增长，预计在2030 年达到16.5 亿，以我国目前的产肉量来看，肉类缺口将达7900 万t[8]。因此，为了满足日益增长的需求，我国未来的家禽产业急需进一步提升育种技术水平，在加强优质高生产效益品种培育的基础上实现向高质量发展转型已成为我国家禽产业必然的发展趋势。

传统育种技术是基于遗传重组和表型选择的杂交选育过程，多年来为家禽产业培育出了大批优质高产品种，推动了家禽产业的高速发展。但随着家禽生产水平的提高，仅依靠传统育种技术，继续提高家禽生产性能的成效越来越小，传统育种中优良基因与不良基因的连锁遗传、表型测定结果易受环境影响、育种效率低、育种周期长等问题开始掣肘育种进程[1]。随着生命科学的快速发展，以生物育种技术为核心，交叉融合了遗传学、分子生物学和计算机科学等多学科领域的现代育种体系诞生并得到广泛应用，大大提高了育种效率、加快了育种进程。基因编辑技术是现有生物育种技术中发展最快、针对单一性状改良效率最高的育种技术，是突破传统育种技术面临的不良基因连锁等瓶颈问题的关键[8]。基因编辑技术不断的改良发展和应用正悄然推动着农业领域的颠覆性变革。

1 基因编辑技术的发展现状

1.1 基因组修饰系统

1.1.1 ZFN 基因编辑系统

锌指核酸酶（Zinc Finger Nuclease，ZFN）技术由2 个关键部分组成：锌指蛋白和FokI 核酸内切酶。通常锌指蛋白包含3～6 个锌指结构域，每个结构域都与DNA 的特定核苷酸序列结合。这种高度特异性的结合使锌指蛋白能精确识别和结合到基因组的目标区域。FokI 核酸内切酶必须以二聚体的形式出现才能具备核酸酶活性，因此需要成对的锌指蛋白将其引导到靶位点，从而实现其剪切功能[9,10]。通过对锌指蛋白进行设计和工程化，研究人员能设计合成识别和结合特定的DNA 序列的锌指蛋白，为精确编辑基因组提供了可能性。

1.1.2 TALEN 基因编辑系统

转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN）类似于ZFN，是一种可以实现DNA 序列特异性切割和编辑的核酸酶[11]。TALE 蛋白来自植物病原菌，具有特殊的DNA 识别能力。每个TALEN 蛋白包含一系列高度重复的结构单元，这些单元被称为“重复”。每个重复都能识别和结合到DNA 的一个碱基对。TALEN 蛋白的特异性来自于这些重复单元，其序列和排列可以根据所需编辑的DNA序列进行定制。通过精心设计TALEN 蛋白的重复序列，可以实现对目标DNA 的高度特异性识别。与ZFN 类似，TALEN 也需要结合FokI 核酸内切酶，对靶位点进行切割，从而实现基因编辑的目标。

1.1.3 CRISPR/Cas 基因编辑系统

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）是规律间隔成簇短回文重复序列的缩写，最早于1987 年由日本科学家在大肠杆菌中发现。当时科学家们虽然注意到存在短串联重复的DNA 序列，但并未揭示其功能[12]。直到2002 年，科学家正式将这些结构命名为CRISPR，并研究揭示了一些与CRISPR 结合相关的蛋白，命名为Cas（CRISPRassociated protein），它们与CRISPR 一起构成了CRISPR/Cas 系统[13,14]。这一系统具有识别外源DNA 并将其整合到CRISPR 序列中间，从而构建对外源DNA 的适应性免疫系统的能力。当外源DNA 再次进入细菌时，CRISPR/Cas 系统可以识别并对其进行抑制。基于这一机制，研究人员开发了能够针对特定DNA 序列的基因编辑系统。

（1）核酸酶

2012 年，Doudna 和Charpentier 团队使用源自化脓杆菌的CRISPR/Cas 系统成功实现了在大肠杆菌中对靶基因的编辑[15]。这一系统的核心是Cas9 蛋白，它能在CRISPR RNA（crRNA）和反式激活的CRISPR RNA（trans-acting CRISPR RNA，tracRNA）的协同作用下，对特定DNA 进行切割，造成靶向DNA 双链断裂（Double Strand Break，DSB）。一旦CRISPR/Cas9 系统在靶位点引发DSB，细胞通常会通过2 种自我修复机制来应对：非同源末端连接和同源重组。非同源末端连接可以在靶基因的编码区域进行编辑，它通过在DNA 双链断裂处插入或删除碱基对来导致移码突变，从而破坏了基因的正常功能。此外，还可以在附近的多个位置设计打靶位点，以增加删除特定DNA 序列的可能性，以达到特定的基因修饰目的。另一方面，可以通过提供模板DNA，利用同源重组修复方式来实现特定的基因突变，但这种方法的整体效率相对较低。

Cas9 蛋白主要由一些关键结构域组成，包括Rec 结构域用于识别，RuvC 和HNH 结构域用于切割、以及原间隔相邻基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）相互作用结构（PAM Interacting Domain，PI）域用于与PAM 结合等[16]。在选择靶序列时，需要确保在打靶位置的3' 端存在PAM 结构，以区分自身与非自身的DNA。在Sp-Cas9 系统中，PAM 的典型序列为 “NGG”。cr-RNA 由5' 端引导序列和3' 端重复序列构成，其中引导序列能够靶向结合DNA，类似于CRISPR中的间隔序列。重复序列能与tracRNA 形成稳定的茎环结构，而Cas9 蛋白主要与茎环结构相结合。因此，在crRNA 引导序列的指导下，Cas9蛋白能识别靶标并对其进行切割。但crRNA 与tracRNA 在细菌内形成茎环结构的过程相对繁琐。因此，研究人员通过将这两种RNA 直接连接起来，形成一个二级结构相似的单嵌合体RNA（single chimera RNA，sgRNA），简化了CRISPR/Cas9 系统。2013 年，张锋等[17]也研发了CRISPR/Cas9 系统，该系统能够在哺乳动物细胞内进行高效的基因编辑。与Doudna 等[15]系统相比，这一系统的Cas9 蛋白具有额外的核定位信号，使其能够进入细胞核进行编辑。此外，还延长了sgRNA 中的tracRNA 长度，增强了与Cas9蛋白的结合稳定性，从而提高了基因编辑效率。

（2）单碱基编辑系统

2016 年，David 等[18]开发了胞嘧啶单碱基编辑器（Cytosine Base Editor，CBE），其原理是先通过对Cas9 蛋白的RuvC 结构域引入D10A 突变，以及对HNH 结构域引入H840A 突变，将Cas9 蛋白改造成了无切割活性的Cas9（dead Cas9，dCas9），使其仅具备结合DNA 的能力，而不再具有切割活性；然后，在dCas9 蛋白的氨基端添加了来自大鼠胞嘧啶脱氨酶rApobec1，该脱氨酶的功能是将单链DNA 中的胞嘧啶核苷酸C 脱氨基化，转化为尿嘧啶核苷酸U。这一系统被称为BE1，其工作原理是在sgRNA 的引导下，dCas9 将rApobec1 引导到靶位点，使目标链被sgRNA 捕获，而非目标链则暴露出来。此时，rApobec1 能够结合非目标链，对C 进行脱氨化，将其转化为U。在随后的DNA 复制过程中，U将与腺嘌呤核苷酸A 互补配对，最终达到C 到T的突变。

早期研发的BE1 的编辑效率非常低，随后的研究通过在BE1 的羧基端添加了尿嘧啶糖基酶抑制蛋白（Uracil Glycosylase Inhibitor Protein，UGI），抑制了尿嘧啶糖基酶的活性，降低尿嘧啶脱氨酶将DNA 中的U 去除修复为T 的能力，从而提高C 到T 的编辑效率。为了进一步提高编辑效率，将编辑器BE2 的dCas9 改为nCas9（nick-Cas9，nCas9），保留了Cas9 的切割靶向链的活性，得到BE3。BE3 在rApobec1 将非靶向链上的C 转化为U 的同时，使靶向链产生切口，促使靶向链以非靶向链为模板进行DNA 修复，进一步提高了编辑效率。尽管BE3 的编辑效率相对较高，但仍然存在一些局限性。因此，研究者通过使用人类胞嘧啶脱氨酶代替rApobec1，进一步提高了编辑效率[19]。此外，脱氨酶本身可能会随机结合到非靶位置的单链DNA 或RNA 上，导致非sgRNA 依赖性的随机脱靶[20]。为了降低这一风险，研究者采取了多种策略，如降低胞嘧啶脱氨酶对单链DNA 或RNA 的结合能力[21]，或者在编辑器上添加胞嘧啶脱氨酶抑制蛋白来降低脱靶[22]，但这些策略在减少脱靶的同时也都在一定程度上降低了编辑效率或限制了可用位点。

2017 年，David 团队[23]研发了腺嘌呤单碱基编辑器（Adenine Base Editor，ABE）。ABE 由nCas9 的与来自大肠杆菌的腺嘌呤脱氨酶TadA融合而成。通常，天然的TadA 需要两个TadA分子形成二聚体，以对tRNA 的腺嘌呤核苷酸A进行脱氨化，将其转化为次磺嘌呤核苷酸I。通过定向进化，研究人员获得了由野生型TadA、突变型TadA 和nCas9 组成的ABE 7.10 系统。在ABE 系统中，腺嘌呤核苷酸A 被转化为I，然后I 与C 互补配对，最终实现A 到G 的突变。尽管ABE 7.10 系统具有高度的编辑效率，但仍然存在RNA 脱靶风险[24]。为了降低这种风险，研究者采取了多种策略，包括降低其对RNA 的结合能力或只使用单个突变型TadA[25]等，获得了效率更高的ABE8e 系统[25]。另外，将CBE 的UGI 改为尿嘧啶脱氨酶可以使C 转化为G，从而形成CGBE编辑器[26,27]。通过在ABE 中引入MPG，可以将A转化为Y（C 或T），形成AYBE 系统[28]。还有研究者将TadA 添加到CBE 上，实现AC 到GT 的同时编辑，被称为ACBE[29]。

（3）先导基因编辑系统

2019 年，David 团队[30]研发了引导编辑系统（Prime Editing，PE），它在不引发DSB 的情况下实现了对基因组的任意碱基编辑以及小片段插入或删除，极大提高了基因编辑工具的可用性。PE系统主要由两部分组成：一是H840AnCas9 蛋白与逆转录酶的融合蛋白，二是pegRNA。pegRNA不仅包含通常sgRNA 的引导序列和支架序列，还在其3' 端添加了逆转录模板序列（RTT）和引导结合序列（PBS）。PE 系统的工作原理是在切割非靶向链后，PBS 通过碱基互补配对结合到非靶向链的3'末端的互补部分，提供了羟基。在RTT的模板作用下，逆转录酶合成所需的DNA 序列，最终在DNA 修复或复制过程中保留了所编辑的结果，从而实现了基因编辑的目标。后续研究者通过在靶位点下游引入靶向链切口，提高了PE系统的编辑效率。此外，还通过改变pegRNA 的支架结构、增加与DNA 错配修复Cas9 蛋白结合的稳定性、在PBS 的3'端增加保护序列等方式来提高编辑效率。通过引入DNA 错配修复抑制蛋白，也能提高PE 系统的编辑效率[31,32]。

1.2 家禽基因编辑细胞工具

1.2.1 胚胎干细胞

胚胎干细胞（Embryonal Stem Cell，ESC）来源于早期胚胎未分化的干细胞，最早从小鼠的胚泡中分离出[33,34]，随后Pain 等[35]成功从鸡胚中分离出了ESC 细胞。ESC 具有多能性，被移植到囊胚后能重新分化成所有胚胎组织细胞，包括生殖系细胞。因此，ESC 分离培养为鸡的基因组操作和转基因鸡的制备提供了重要的细胞工具。Zhu等[36]通过电穿孔法将人单克隆抗体（mAB）转进鸡ESC 中，然后通过ESC 胚胎移植形成管状腺细胞表达mAB 嵌合体鸡。但从鸡早期胚胎中分离的ES 细胞数量少，体外培养体系与哺乳动物差异较大，没有完善的鸡ESC 体外培养体系，且移植到受体胚胎后不能定向分化为生殖细胞，种系传递效率低，限制了ESC 在家禽基因编辑中的应用。

1.2.2 原始生殖细胞

原始生殖细胞（Primordial Germ Cell，PGC）是早期胚胎中精子和卵子的前体细胞，能通过配子发生将遗传物质传递到下一代[37]，是理想的基因编辑细胞工具。在小鼠等哺乳动物中，PGC 从外胚层沿着后肠上皮细胞迁移到性腺附近，并通过肠系膜出口进入性腺中[38]。家禽存在独特的PGC 发育和迁移模式，PGC 最早出现在Eyal-Gi ladi 和Kochav（EGK）X 期胚胎的胚盘中，从胚盘透明区域沿着原条，随着胚胎的形态发生运动被动迁移到生殖新月区；随后，这些PGC 迁移穿过胚胎外血管中进入血液循环系统，随着血液流动迁移出血管并定殖到性腺中[39-41]。根据鸡PGC的迁移路径和胚胎发育模式，结合胚胎操作，能从EGK X 期胚胎的胚盘、Hamburger Hamilton（HH）11 阶段胚胎的血液中以及HH 15～32 阶段胚胎的性腺中分离获得PGC[42]。Van de Lavoir 等[44]首次成功建立了鸡PGC 的体外长期培养体系，从胚胎血液中获得的PGC 能在添加了碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）、干细胞因子（Stem Cell Factor，SCF）的培养基中体外培养超过35d，在移植到受体胚胎血液系统后，仍然能迁移到性腺中，并分化成功能性配子。Macdonald 等[45]再次证实了这一培养系统对PGC 的有效性。

PGC 分离和体外长期培养体系的建立是基因编辑鸡研究发展的关键。Schusser 等[46]基于PGC体外长期培养系统，采用同源重组技术编辑PGC免疫球蛋白的轻链或重链后，将PGC 移植到HH 13～15 的胚胎血液系统中产生嵌合体，这是第一只通过PGC 体外长期培养和同源重组敲除制备的非哺乳动物的脊椎动物。Whyte 团队[47]对鸡PGC培养进行了进一步优化，开发了鸡PGC 无血清和饲养层的组成明确的培养体系，并确定了鸟类生殖细胞自我更新所需的信号通路。随后，Ballantyne 等[48]利用PGC 体外培养和CRISPR/Cas9 介导的同源性定向修复将iCaspase9基因插入到体外培养的鸡PGC 中DAZL 基因最后一个编码外显子的3' 端，再通过基因编辑成功的PGC 移植入受体胚胎，构建出了诱导不育的宿主鸡。将供体基因组编辑的PGC 移植到不育鸡中，产生只携带外源细胞的嵌合体鸡，将宿主鸡产生供体来源后代的比例提升到100%，进一步提升了基因编辑效率，促进了基因编辑技术在鸡中的应用。陆阳清课题组[49,50]进一步优化了鸡PGC 的体外培养体系，将PGC 建系时间缩短至16d，并利用此培养体系和CRISP/Cas9 系统成功构建了生殖细胞发红色荧光的DAZL-mCherry 基因编辑鸡，为PGC 的增殖、分化、迁移等研究提供了重要的试验模型。目前，PGC 是基因编辑鸡制备主要采用的细胞工具。

1.2.3 精原细胞

精原干细胞（Spermatogonial Stem Cell，SSC）具有自我更新或分化的能力，能分化成雄性生殖细胞系中所有的生殖细胞类型[51]，通过受精将遗传信息传递给下一代，也是基因编辑理想的细胞工具之一。1994 年，Brinster 和Zimmermann 从小鼠睾丸中分离SSC 注射到不育小鼠睾丸的曲精细管中，发现受体睾丸的供精细胞精子发生表现出正常的形态特征，并产生成熟精子，首次建立了SSC 的移植体系[52]。此后，SSC 移植在大鼠[53]、狗[54]、猪[55]和奶牛[56]上都成功实现。在禽类中，Lee 等[57]在2006 年将成年或幼年的公鸡睾丸中分离获得的生殖细胞移植到成年白来航公鸡的睾丸中，形成了异种精原细胞嵌合体的公鸡，首次证明了鸡精原干细胞睾丸移植的可行性。Jung 等[58]将成年公鸡的SSC 移植到E&GxX期和HH 14 期的鸡胚胎中，发现移植的SSCs 能迁移到受体鸡胚的性腺中。同时，Roe 等[40]将从鹌鹑睾丸中分离出的SSC 移植到鸡HH 14～17 胚胎的血液系统中，注射4h 后在受体鸡胚的性腺中观察到了供体来源的细胞。

但这些尝试都是基于原代SSC 的分离和移植，而SSC 在基因编辑中广泛应用仍需要优化SSC 的分离和体外培养体系，以获得足够数量细胞用于体外操作。在体内，SSC 生长很大程度上受周围支持细胞、间质细胞和类肌细胞构成细胞构成的生态环境的调控。支持细胞和类肌细胞分泌神经胶质衍生的神经营养因子（Glial Cell Derived Neurotrophic Factor，GDNF）和间质细胞产生集落刺激因子1（Colony Stimulating Factor 1，CSF1）都有促进SSC 增殖的作用[59-61]。通过体外重建微环境进行SSC 体外长期培养较为困难，有几个实验室尝试了小鼠SSC 的体外培养，Kubota等[62]通过添加GDNF 使体外培养的幼鼠睾丸SSC持续增殖超过6 个月，且在移植到不育小鼠睾丸后重建了小鼠睾丸内长期的精子发生过程，并恢复了不孕受体小鼠的生育能力。但禽类SSCs 仍未建立完善的体外长期培养体系，Rasouli-Gharehsaghal等[63]将未性成熟公鸡的精原干细胞分离并培养7d，将携带报告基因GFP 的质粒载体pDB2 转染到SSC 中，并将转染的SSC 移植到不育公鸡的左侧睾丸中。因此，鸡SSC 的体外长期培养体系仍需进一步优化来推动SSC 在基因编辑广泛应用。

2 基因编辑技术在家禽中的应用

2.1 提高产肉量和饲料利用率

在促进肌肉生长的遗传因素中，肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN），也被称为生长分化因子8，是促进肌肉生长最突出的基因之一，可以作为促进肌肉生长的标记基因，其主要在骨骼肌中表达，通过与激活素受体2B 型（Activin A Receptor Type 2B，ACVR2B）结合，激活1 型激活素接收器丝氨酸激酶ALK4 和ALK5，使Smad2 和3 被磷酸化并转移到细胞核，启动下游基因转录的变化，最终抑制肌肉分化和生长[38,64]。Kim 等[65]通过D10A-Cas9 DNA 切口酶系统敲除鸡原始生殖细胞内的MSTN 基因，并将其移植到受体鸡胚中产生MSTN 敲除的基因编辑鸡。与野生型鸡相比，MSTN 敲除鸡胸部和腿部骨骼肌更大，但肌肉生长抑制素缺失引起的骨骼肌肥大和增生程度因性别和肌肉类型而异。此外，MSTN敲除鸡的腹部脂肪沉积也显著低于野生型鸡。Lee 等[66]通过将含有CRISPR/Cas9 的重组腺病毒注射到鹌鹑胚细胞中，产生了MSTN 基因前肽区第42 位半胱氨酸缺失的基因编辑个体，与野生鹌鹑相比，MSTN 突变鹌鹑的脂肪垫重量和心脏重量分别以年龄和性别依赖的方式降低。这些研究表明，基因编辑技术可以成功创制出肌肉生长更符合需求的家禽新品种。

脂肪沉积水平是衡量鸡饲料利用率的重要指标，动物身体的能量稳态是由脂质储存和动员的精确调节平衡决定的，减少身体脂肪沉积能促使吸收的能量更多地用于肌肉的生成。脂质的动员主要是脂肪水解酶介导的甘油三酯（Triglyceride，TG）降解释放未酯化的脂肪酸。Zimmermann 等[67]研究发现了第二种脂肪水解酶，脂肪甘油三酯脂肪酶（Adipose Triacylglycerol Lipase，ATGL），在人和小鼠的脂肪组织中高表达，对TG 具有高度的底物特异性，参与催化TG 水解的初始步骤，是TG 水解的限速酶。G(0)/G(1)开关基因2（G0/G1 Switch Gene 2，G0S2）编码的蛋白质是ATGL 的选择性调节因子，在脂肪组织和分化的脂肪细胞中高表达，通过G0S2 的疏水结构域和ATGL 的patatin 样结构域结合与ATGL 特异性相互作用，抑制ATGL 的三酰甘油水解酶活性[68]。Park 等[69]通过结合CRISPR-Cas9 系统和PGC 介导的种系传播制备G0S2 基因敲除鸡，发现G0S2敲除的鸡在其他经济性状没有受到明显影响的情况下表现出腹部脂肪沉积的显著减少。此外，与正常饮食条件下的野生型鸡相比，G0S2 敲除鸡的血液和腹部脂肪中的脂肪酸组成发生了变化：游离脂肪酸水平降低，总胆固醇含量增加。这2个基因编辑品种的创制为提高禽肉产量和饲料利用率提供了新的育种素材。

2.2 抗病育种

病毒性疾病给家禽养殖业带来了巨大的经济损失，降低了家禽生产性能，基因编辑技术的兴起为提高家禽的抗病能力提供了新的解决方案。病毒与宿主细胞受体高度特异性相结合，才能进入靶细胞从而发挥致病作用，敲除受体可以特异性阻止病毒感染[70]。此外，病毒受体和病毒复制相关的基因，以及细胞对感染的免疫应答相关的基因都是基因编辑的重点对象[71]。禽白细胞病病毒（Avian Leukosis Virus，ALV）属于逆转录病毒科α 逆转录病毒属，是一组诱导鸟类肿瘤的逆转录病毒，ALV 亚群J（ALV-J）自1988 年在英国首次暴发以来就一直是家禽产业关注的一个重要问题。2018 年中国暴发了一次大规模的ALV-J疫情，疫情鸡群15～20 周龄表现出抑郁、瘫痪和体重减轻，某些鸡群的死亡率达到15%，给中国家禽业造成了巨大的经济损失[72]。鸡Na+/H+交换器类型1（Chicken Na+/H+Exchange Type 1，chNHE1）是AVL-J 的关键受体，其显著的糖基化细胞外环1 是病毒进入所必需的[73]。而在ALV-J 易感物种（家鸡、丛林鸡、火鸡）和抗性物种（大多数鸟类）中的氨基酸序列比较分析结果表明，chNHE1 色氨酸残基38（W38）是受体功能的关键残基[74]。Koslová 等[75]通过CRISPR/Cas9 系统构建了W38 敲除的PGCs，并成功制备了W38 敲除鸡。体外和体内检测了对ALV-J 的耐药性的体内和体外检测结果显示，W38 敲除纯合子鸡表现出对ALV-J 的耐药性，而W38 敲除杂合子和野生型鸡则对ALV-J 敏感。此外，W38的缺失没有显示出任何明显的副作用。这是第一只通过CRISPR/Cas9 和PGCs 系统介导的对某一特定病原体具有抗性的精确基因编辑鸡，是基因编辑技术在抗病鸡品种培育中取得的一次重大进展。

2.3 早期胚胎的性别鉴定

在蛋鸡养殖行业中，公鸡的需求量少，很多蛋鸡养殖场会在雏鸡孵化后立即筛选出雄性并将其安乐死，以降低饲养成本。除了传统的1 日龄雏鸡扑杀外，卵内性别鉴定能进一步降低孵化和人工性别鉴定的成本，并为雏鸡扑杀的伦理问题提供了解决方案。在这方面Lee 等[76]通过CRISPR/Cas9 系统将绿色荧光蛋白GFP 基因插入到鸡PGC 的Z 染色体上，然后通过PGC 胚胎移植技术构建了Z 染色体表达GFP 的基因编辑鸡，这些将表达GFP 的ZW 雌性与野生型ZZ 雄进行交配，产生的雄性后代均表达GFP 绿色荧光，可通过荧光检测进行早期胚胎淘汰。两性和mab-3相关转录因子1（Double Sex-mab3-related Transcription Factor1，DMRT1）是鸡睾丸的决定基因，Lee 等[77]尝试通过CRISP 介导的PGC 基因组修饰来生产DMRT1 敲除的基因编辑鸡来达到早期胚胎性别控制的目的。但由于激素分泌等原因，DMRT1 敲除鸡并未实现性别反转，但为禽类性别控制研究提供了重要线索。

2.4 生物反应器

蛋白质类药物是目前研发较多的一种药物之一，其生产通常是基于细菌和哺乳动物细胞培养系统。然而，细菌细胞培养系统对重组蛋白的糖基化、翻译后修饰有限；从哺乳动物细胞培养系统大规模生产重组蛋白成本昂贵。因此，人们开始尝试通过基因编辑或转基因动物制备生产蛋白类药物。转基因禽类生物反应器生产重组蛋白有几个显著的优势：家禽的饲养成本低、性成熟时间短、蛋白质产量高、卵清蛋白成分简单易于重组蛋白的分离纯化，且能进行类似于人类糖基化的蛋白修饰[78]。因此，通过基因编辑技术精确的将重组蛋白基因整合到卵清蛋白的可编辑位点，制备基因编辑鸡生产重组蛋白，也是未来基因编辑技术在禽类的主要应用方向之一。Oishi 等[79]通过CRISPR/Cas9 系统将人干扰素-β（Human Interferon-β，hIFN-β）精确整合到鸡卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）基因座中，然后将基因编辑的PGC 移植制备获得转基因鸡，所有hIFN-β 敲入的雌性后代蛋清中都产生了丰富hIFN-γ 蛋白（～3.5mg/mL）。尽管第一代的雌性后代是不育的，但其雄性后代是可育的，产生第二代母鸡hIFN-β的产量与第一代相当。这些结果表明，通过CRISPR/Cas9 和PGC 移植基因编辑技术在鸡卵清蛋白基因座插入转基因，可以实现在蛋清中的外源蛋白的丰富和稳定表达。

3 展望

20 世纪90 年代初，DNA 标记技术的开发及在畜牧业中的应用，使世界畜禽育种技术跨入了分子育种时代，传统的遗传学/ 基因组学和选择性育种介导的分子育种技术对牲畜生产和健康产生了变革性影响，但传统的选择育种依赖于自然产生的变异，遗传进展仍然较为缓慢。2005 年以后，基因编辑技术逐渐兴起，为畜禽育种提供了新的理论基础和策略，分子设计育种应运而生。此后，随着CRISPR/Cas9 产生与应用，以及鸡PGC 体外长期培养体系的建立，家禽基因编辑技术在过去20 年中得到了飞速的发展，并应用到家禽育种中，成功创制出抵抗ALV-J 病毒的W38敲除鸡、MSTN 敲除鸡等基因编辑鸡等育种素材，进一步推动着家禽生物育种跨入育种4.0 时代-精准育种时代。但要推动精准育种技术在家禽育种中的快速发展和应用，仍要解决以下5 个方面的问题。

3.1 建立多种禽类的PGC 培养体系

PGC 的体外培养条件具有明显的物种特异性，目前仅成功构建了成熟的鸡PGC 体外培养体系，并通过PGC 介导的基因编辑技术实现了关键基因的敲入或敲除。鹌鹑、鸭、火鸡等其他禽类虽分离出了PGC，但均尚未建立起完善的PGC体外长期培养体系，限制了PGC 介导的基因编辑技术在鹌鹑、鸭等禽类上的应用。因此，构建出不同禽类PGC 的最佳培养体系、促进基因编辑技术在野鸡、鹌鹑、火鸡或鸭子关键基因敲除或敲入上的应用将是以后基因编辑技术的重要研究方向之一。有研究通过腺病毒感染或体内PGC 转染的方法成功编辑出了携带荧光基因编辑鹌鹑[80,81]和MSTN 插入突变的基因编辑鸭[82]，但基因编辑效率较低。此外，Cooper 等[83]通过没有PGC 介导的精子转染辅助基因编辑技术（STAGE）成功产生了GFP 敲除胚胎和鸡。但这些方法仍处于发展的早期阶段，尚不清楚其是否像PGC 培养或直接注射一样灵活、高效或稳健，有待进一步的验证和优化。

3.2 提高基因编辑的实用性与安全性

基因编辑技术在不同细胞类型和生物体中的编辑效率存在显著差异。尽管最常用的SpCas9能实现较高的DNA 双链断裂效率，但DSB 对细胞可能产生不利影响，如可能导致染色体倒位易位或过度激活P53 等基因[84]。与之不同，单碱基编辑器虽然不会引发DSB，但它引入脱氨酶，从而增加脱靶风险[20]。目前，各种策略用于减少脱氨酶导致的脱靶效应，但几乎都伴随着编辑效率的下降。因此，如何在维持编辑效率的前提下降低脱靶风险是一个亟待解决的问题。此外，尽管PE 技术具有实现任意碱基突变以及小片段插入或删除的潜力，但其整体编辑效率相对较低。而且PE 系统相对较大，导致递送方面存在挑战。因此，如何提高PE 的编辑效率并减小其体积是当前迫切需要解决的问题。除此之外，SpCas9 拥有一定的NGG PAM 限制，而SpRY 虽然解除了PAM 限制，但效率显著下降，且伴随着脱靶风险增加[85]。因此，如何开发更高效且具有更小PAM限制的编辑器仍然是需要解决的问题。

3.3 转基因递送系统优化

CRISPR/Cas 表达系统通常以质粒、RNA 和RNP（Ribonucleoprotein）的形式进行转染递送到细胞内。在体外培养细胞中，递送方法包括显微注射、电转、病毒感染和脂质体转染等多种方式。但由于PGC 的特殊性，目前递送系统的效率都不高，特别是对分子量比较大的核酸质粒或蛋白，转染递送的效率更低。对于体内递送，目前主要依赖AAV 病毒感染，但AAV 病毒对编辑工具的包装大小有一定限制，一般要求DNA 大小在4.2 kb 以下。此外，体内递送也采用脂质体纳米粒子，它们可以包装DNA、RNA 和蛋白质，且大小限制较小，但递送效率相对较低，且靶向性不够特异。因此，开发出不受大小限制、高效且具有特异性的递送系统仍然是需要解决的问题。

3.4 功能关键基因的挖掘

随着测序技术的发展，家禽遗传图谱绘制促进了更多改善经济性状的遗传变异，这些DNA信息除了用于选择性育种外，也可应用于基因编辑。与哺乳动物相比，家禽重要经济性状关键候选基因的基因编辑成功应用的案例较少。未来，基于基因组测序数据确定的目标位点功能分析验证，并结合精确基因组编辑技术，能够直接引入与经济重要性状相关的新等位基因，赋予其抗病性和耐热性等理想的性状，提高生产力。此外，家禽的繁殖性能、抗病力等都是受多个基因控制的复杂性状，通常是由主效基因及其互作基因构成的调控单元共同调控目标性状的形成。因此，除了单个关键功能基因的筛选，挖掘和解析调控复杂经济性状的 “分子模块”，并结合基因编辑技术进行分子模块设计育种是未来实现高产、优产、稳产、抗病力强的家禽新品系创制的重要方法[8]。

3.5 建立健全基因编辑动物商业化应用的监管政策

基因编辑技术的快速发展在推动畜禽育种技术发展的同时也伴随着生物安全隐患、生态平衡和动物福利伦理等问题。因此，通过国家监管门槛的设定，建立消费者对基因编辑产品的信心是影响精准育种发展和基因编辑技术应用程度的关键因素之一。2017—2021 年，美国食品药品监督管理局已先后批准了AquuAdvantage 三文鱼、GalSafe 猪和PRLR-SLICK 牛3 种供人类食用的基因编辑动物上市销售，建立了使用基因组编辑技术以及重组DNA 构建体等技术开发的蓄意基因组改变动物监管体系，为以后的基因编辑使用动物的上市铺平了道路。欧盟转基因生物、由转基因生物制成的食品和饲料以及由转基因生物组成或含有转基因生物的食品/ 饲料制定了全面而严格的法律制度，但是否将基因编辑生物归类于转基因生物欧盟成员国之间仍未达成统一[86]。日本政府经过安全测试批准了238 种转基因食品和食品添加剂，是世界上最大的转基因作物进口国之一[87]。中国也在大力支持基因编辑技术的创新、发展和应用，在2022 年发布了《基因编辑植物的安全评价指南》，但目前还没有基因编辑动物的安全评价指南或相关监管政策[88]。因此，随着基因编辑技术在动物中的应用，我国亟需出台合理的监管政策，确保基因编辑技术在动物育种中充分发挥潜力。