水飞蓟宾抑制Fas/FasL信号通路对肺结核大鼠炎症损伤及巨噬细胞凋亡的影响

王莲珊 王家贤 郑成芳 （海南西部中心医院，儋州 571700）

肺结核（tuberculosis，TB）是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染肺部引起的炎症损伤性疾病［1］。TB的根治方法非常有限，其较高的传染性及致死率一直受到社会公共卫生的关注［2］。近年研究发现，肺部巨噬细胞外源性凋亡是导致Mtb感染加重及抗感染根治治疗失败的关键因素［3］。

细胞膜死亡受体Fas及其配体FasL（Fas/FasL）均可通过促进半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶8或3（caspase8/3）活化进而促进细胞凋亡［4］。已有研究发现，巨噬细胞可识别Mtb，并与蛋白溶酶体结合杀灭Mtb，发挥抗炎反应的过程中，Fas/FasL可通过caspase8/3途径诱导感染的巨噬细胞凋亡，导致Mtb释放，加重组织损伤［5］。提示抑制Fas/FasL及caspase8/3巨噬细胞凋亡途径活化可能是治疗TB的潜在策略。

水飞蓟素具有抗菌、抗炎及免疫调节作用，常用于肝脏炎症及纤维化等疾病的治疗［6］。近年研究发现，水飞蓟素可抑制Mtb体内及体外感染诱发的组织免疫炎症损伤，提示水飞蓟素可能是治疗TB的潜在药物［7］。水飞蓟宾是水飞蓟素的主要活性物质，其抗TB肺组织炎症损伤的作用是否与抑制Fas/FasL介导的巨噬细胞凋亡有关尚未见报道。本研究通过建立大鼠TB模型对此进行验证，以期为TB靶向药物的研发及水飞蓟宾的开发应用提供可靠资料。

1 材料与方法

1.1 材料 93只清洁级健康SD大鼠，雌雄不限，体质量200～220 g，7～8周龄，购自广东至远生物医药科技有限公司，生产许可证号：SCXK（粤）2021-0057；动物实验符合3R原则，研究经海南西部中心医院伦理委员会批准（ICAU-2021030428）。

水飞蓟宾（货号：YG11242，上海韵泰信息科技公司，规格20 mg）；结核分枝杆菌（Mtb）（货号：19080312，中国药品生物制品检定所）；Fas过表达重组蛋白（pcDNA-Fas）及其阴性对照（pcDNA-NC）均由上海生工公司合成设计；TNF-α（货号：R31733）、IL-6（货号：R31744） ELISA试剂盒购自上海圻明生物科技公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒（货号：S0185XL，上海雅吉生物科技公司）；HE染色液（货号：SY2022）、抗酸染色试剂盒（货号：YT8837）购自北京伊塔生物科技公司；兔抗大鼠Fas、FasL、caspase8、caspase3、巨噬细胞炎症蛋白（MIP-2）等抗体均购自美国Abcam公司；Cyto-FLEX流式细胞仪购自浙江贝克曼公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分组 取SD大鼠78只，参照文献［8］方法制备Mtb液，并经尾静脉注射5 mg/ml的Mtb液0.2 ml建立TB模型，造模后第2天，随机取3只解剖，取肺组织，肉眼可见肺组织中出现白色结节或颗粒样病灶，视为造模成功（75只），将造模成功的大鼠随机分为模型组、水飞蓟宾组、Fas过表达重组蛋白（pcDNA-Fas）组、pcDNA-Fas阴性对照（pcDNA-NC）组、水飞蓟宾+pcDNA-Fas组，每组15只；另取15只大鼠，经尾静脉注射0.2 ml生理盐水，作为正常对照组。

各组均于造模分组后开始给药，水飞蓟宾组参照文献［9］方法灌胃给予100 mg/kg水飞蓟宾，1次/d；pcDNA-Fas组及pcDNA-NC组尾静脉注射1 nmoL/L的pcDNA-Fas及pcDNA-NC试剂（含绿色荧光标记的GFP蛋白），200 μl/kg，每2 d给药1次；水飞蓟宾+pcDNA-Fas组给予水飞蓟宾的同时给予pcDNA-Fas试剂；模型组及对照组灌胃给予10 ml/kg生理盐水。各组连续给药30 d，给药期间观察大鼠饮食、活动及死亡状况。

1.2.2 肺泡巨噬细胞凋亡率检测 各组大鼠麻醉后处死，切开气管，结扎左肺，取5 ml生理盐水灌洗右肺，得肺泡灌洗液，参照文献［10］方法收集及纯化肺泡灌洗液中的巨噬细胞，按AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒说明书方法孵育巨噬细胞，流式细胞仪测定肺泡巨噬细胞凋亡率。

1.2.3 抗酸染色检测肺Mtb感染情况 取大鼠完整左肺组织，分成两部分，一部分置于液氮中保存备用，另一部分于4%多聚甲醛中固定24 h后，制成5 μm厚石蜡切片，取部分石蜡切片，脱蜡、脱水及流水冲洗后，加苯酚复红溶液37 ℃染色15 min，酸性乙醇脱色120 s，亚甲基蓝复染30 s后，油镜下观察Mtb染色情况。

1.2.4 HE染色观察肺组织病理变化 取左肺组织石蜡切片，根据HE染色液说明书方法染色后，置于光镜下观察拍照。

1.2.5 ELISA法检测肺组织TNF-α、IL-6水平 取液氮中保存的肺组织，剪取0.5 g，粉碎、匀浆处理后，ELISA试剂盒检测匀浆液中TNF-α、IL-6水平。

1.2.6 Western blot检测肺组织蛋白表达 取液氮中保存的肺组织，冰上研磨匀浆后，提取匀浆液中的蛋白，BCA法检测蛋白浓度，取40 μg蛋白进行电泳和电转膜操作，封闭液封膜100 min后，湿盒中滴加1∶600的Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2一抗及1∶1 200的β-actin内参抗体孵育24 h，1∶1 600的HRP羊抗兔二抗37 ℃孵育80 min后，增强化学发光液显影曝光，Image J软件分析条带相对灰度值。

1.2.7 pcDNA-Fas及pcDNA-NC靶向肺泡细胞、巨噬细胞判定 pcDNA-Fas及pcDNA-NC质粒中含绿色荧光标记的GFP蛋白，取pcDNA-Fas组及pc-DNA-NC组大鼠肺泡灌洗液中的巨噬细胞于荧光显微镜下观察绿色荧光强度，液氮中保存的肺组织切成20 μm厚的冰冻切片若干，于荧光显微镜下观察绿色荧光强度（以Image Pro Plus 6.0图像系统检测每5个视野下单位面积内绿色荧光染色的平均光密度值）。

2 结果

2.1 水飞蓟宾对大鼠行为变化的影响 正常对照组大鼠无死亡，饮食及活动正常。模型组、pcDNANC组、水飞蓟宾+pcDNA-Fas组大鼠各死亡2只，均出现不同程度的呼吸急促、喘息及毛发枯槁现象。水飞蓟宾组无死亡，呼吸急促、喘息减轻。pcDNAFas组大鼠有4只死亡，呼吸急促及喘息现象加重。提示水飞蓟宾能够改善Mtb诱导的TB大鼠体征，过表达Fas能加重Mtb诱导的TB大鼠体征。

2.2 pcDNA-Fas及pcDNA-NC在肺组织及肺泡巨噬细胞中定向表达变化 荧光显微镜下观察可见，pcDNA-Fas及pcDNA-NC组大鼠肺组织细胞及肺泡巨噬细胞表面均显绿色荧光，且荧光强度差异无统计学意义（P＞0.05），提示pcDNA-Fas及pcDNA-NC试剂可定向分布于肺组织细胞及肺泡巨噬细胞表面。见图1、表1。

表1 肺组织及肺泡巨噬细胞GFP绿色荧光强度比较（，mean optical density/mm2）Tab.1 Comparison of GFP green fluorescence intensity in lung tissue and alveolar macrophages （，mean optical density/mm2）

表1 肺组织及肺泡巨噬细胞GFP绿色荧光强度比较（，mean optical density/mm2）Tab.1 Comparison of GFP green fluorescence intensity in lung tissue and alveolar macrophages （，mean optical density/mm2）

Groups pcDNA-Fas pcDNA-NC n 11 13 Lung tissue 1.06±0.14 1.02±0.16 Alveolar macrophage 1.09±0.12 1.13±0.13

图1 肺组织细胞及肺泡巨噬细胞GFP绿色荧光观察Fig.1 GFP green fluorescence observation of lung tissue cells and alveolar macrophages

2.3 水飞蓟宾及过表达Fas对大鼠肺组织炎症因子TNF-α、IL-6水平的影响 与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织炎症因子TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05）。与模型组相比，水飞蓟宾组大鼠TNF-α、IL-6水平降低（P＜0.05）；pcDNA-Fas组大鼠TNF-α、IL-6水平较模型组进一步升高（P＜0.05）。pcDNANC组TNF-α、IL-6水平与模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。与水飞蓟宾组相比，水飞蓟宾+pcDNA-Fas组大鼠TNF-α、IL-6水平升高（P＜0.05），见表2。提示水飞蓟宾可明显改善TB模型大鼠的炎症损伤，过表达Fas与水飞蓟宾的作用正好相反，且能够部分逆转水飞蓟宾对炎症损伤的抑制作用。

表2 大鼠肺组织炎症因子TNF-α、IL-6水平比较（，pg/g）Tab.2 Comparison of TNF-α， IL-6 levels in lung tissues of rats （，pg/g）

表2 大鼠肺组织炎症因子TNF-α、IL-6水平比较（，pg/g）Tab.2 Comparison of TNF-α， IL-6 levels in lung tissues of rats （，pg/g）

Note：Compared with normal control group， 1）P＜0.05； compared with model group，2）P＜0.05；compared with Silybin group，3）P＜0.05.

IL-6 22.22±2.02 89.83±8.061）30.62±3.042）199.41±19.042）3）90.97±9.083）60.82±6.052）3）Normal control Model Silybin pcDNA-Fas pcDNA-NC Silybin+pcDNA-Fas 15 13 15 11 13 13 12.36±1.04 78.82±7.061）20.66±2.052）189.49±18.042）3）80.99±8.073）50.80±5.062）3）GroupsnTNF-α

2.4 水飞蓟宾及过表达Fas对大鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响 与正常对照组相比，模型组大鼠肺泡巨噬细胞凋亡率升高（P＜0.05）。与模型组相比，水飞蓟宾组大鼠肺泡巨噬细胞凋亡率降低（P＜0.05）；pcDNA-Fas组大鼠肺泡巨噬细胞凋亡率较模型组进一步升高（P＜0.05）。pcDNA-NC组肺泡巨噬细胞凋亡率与模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。与水飞蓟宾组相比，水飞蓟宾+pcDNA-Fas组大鼠肺泡巨噬细胞凋亡率升高（P＜0.05），见图2、表3。提示水飞蓟宾可降低TB模型大鼠肺泡巨噬细胞凋亡，而过表达Fas可使水飞蓟宾的抗凋亡作用得以消除，至少是部分消除。

表3 各组大鼠肺泡巨噬细胞凋亡率比较（，%）Tab.3 Comparison of apoptosis rates of alveolar macrophages in each group （，%）

表3 各组大鼠肺泡巨噬细胞凋亡率比较（，%）Tab.3 Comparison of apoptosis rates of alveolar macrophages in each group （，%）

Note：Compared with normal control group， 1）P＜0.05； compared with model group，2）P＜0.05；compared with Silybin group，3）P＜0.05.

Apoptosis rate of 5.06±0.52 37.24±3.311）18.69±1.052）48.68±4.662）3）36.17±3.093）29.92±2.032）3）Groups Normal control Model Silybin pcDNA-Fas pcDNA-NC Silybin+pcDNA-Fas n 15 13 15 11 13 13

图2 流式细胞术检测肺泡巨噬细胞凋亡Fig.2 Apoptosis of alveolar macrophages detected by flow cytometry

2.5 水飞蓟宾及过表达Fas对大鼠肺组织Mtb感染的影响 正常对照组肺组织无Mtb感染。模型组大鼠可见肺组织Mtb呈杆状、串珠状成团聚集，且红染严重。与模型组相比，水飞蓟宾组Mtb聚集减少，红染变浅。pcDNA-Fas组大鼠Mtb团状聚集及红染加重。pcDNA-NC组Mtb聚集、红染与模型组相近。水飞蓟宾+pcDNA-Fas组大鼠红染重于水飞蓟宾组，见图3。提示水飞蓟宾可减轻TB大鼠肺部感染，而过表达Fas可使感染加重。

图3 大鼠肺组织抗酸染色（×1 000）Fig.3 Acid-fast staining of rat lung tissue （×1 000）

2.6 水飞蓟宾及过表达Fas对大鼠肺组织病理变化的影响 正常对照组大鼠肺组织无病理性改变。模型组、pcDNA-NC组大鼠肺组织呈干酪样坏死纤维化，组织有充血，结核结节形成及炎症细胞浸润严重。水飞蓟宾组大鼠肺组织干酪样坏死、炎症细胞浸润缓解和形态改善显著。pcDNA-Fas组大鼠肺组织干酪样坏死纤维化、炎症浸润、充血最严重。水飞蓟宾+pcDNA-Fas肺组织病变略重于水飞蓟宾组，见图4。提示水飞蓟宾能明显改善大鼠的肺部损伤，而过表达Fas可加速大鼠肺组织损伤。

图4 大鼠肺组织HE染色（×200）Fig.4 HE staining of rat lung tissue （×200）

2.7 水飞蓟宾及过表达Fas对大鼠肺组织蛋白表达的影响 与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表达升高（P＜0.05）。与模型组相比，水飞蓟宾组大鼠肺组织Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表达降低（P＜0.05）。pcDNA-Fas组大鼠肺组织Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表达较模型组进一步升高（P＜0.05）。pcDNA-NC组Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表达与模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。与水飞蓟宾组相比，水飞蓟宾+pcDNA-Fas组大鼠Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表达升高（P＜0.05），见图5、表4。提示水飞蓟宾可抑制Fas/FasL依赖的caspase8/3信号活化，过表达Fas后水飞蓟宾的抑制作用得到逆转。

表4 各组大鼠肺组织Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表达比较（）Tab.4 Comparison of Fas， FasL， caspase8， caspase3， MIP-2 protein expressions in lung tissues of rats in each group （）

表4 各组大鼠肺组织Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表达比较（）Tab.4 Comparison of Fas， FasL， caspase8， caspase3， MIP-2 protein expressions in lung tissues of rats in each group （）

Note：Compared with normal control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with Silybin group， 3）P＜0.05.

MIP-2/β-actin 1.05±0.16 2.19±0.211）1.36±0.132）2.85±0.282）3）2.12±0.203）1.81±0.182）3）Groups Normal control Model Silybin pcDNA-Fas pcDNA-NC Silybin+pcDNA-Fas n 15 13 15 11 13 13 Fas/β-actin 1.09±0.10 2.05±0.201）1.28±0.132）2.88±0.252）3）2.09±0.203）1.68±0.172）3）FasL/β-actin 1.03±0.10 2.00±0.181）1.20±0.122）2.98±0.242）3）1.98±0.193）1.69±0.152）3）caspase8/β-actin 1.09±0.10 2.17±0.201）1.43±0.142）2.83±0.202）3）2.16±0.213）1.72±0.152）3）caspase3/β-actin 1.07±0.08 2.27±0.201）1.29±0.122）2.79±0.202）3）2.23±0.233）1.87±0.182）3）

图5 Western blot检测各组大鼠肺组织Fas、FasL、caspase8、caspase3、MIP-2蛋白表达Fig.5 Fas， FasL， caspase8， caspase3， MIP-2 protein expressions in lung tissues of rats in each group

3 讨论

我国TB发病率位居全球第二［11］。TB的主要致病菌——Mtb是传染病中的头号杀手，可破坏机体免疫功能，引起组织干酪样坏死［12-13］。巨噬细胞是机体天然免疫系统中的重要效应细胞，是机体抵抗病原微生物的第一道防线，大量研究发现，Mtb侵入机体后，巨噬细胞迅速识别Mtb的抗原，并以内吞或抗原呈递的方式启动机体免疫，清除并抵抗Mtb进一步入侵组织细胞［14］。但近期研究发现，Mtb也可诱导巨噬细胞凋亡或形成无抗炎作用的泡沫细胞，以产生抗吞噬能力，进而促进其在机体宿主细胞内存活，并认为Mtb诱导的巨噬细胞凋亡是引起TB肺组织炎症损伤、干酪样坏死的重要原因［3，15］。本研究建立大鼠TB模型后发现，肺组织巨噬细胞凋亡率升高，Mtb在肺组织中成团聚集，肺组织结节形成及干酪样坏死严重，炎症细胞-白介素数目及炎症因子TNF-α、IL-6表达升高，提示TB大鼠出现巨噬细胞凋亡、Mtb感染及肺组织炎症损伤现象，表明造模成功。

目前临床上主要以利福平、雷米封等药物治疗TB，但这些药物治疗疗程较长，且对肝肾功能影响较大，不利于长期应用［16］。水飞蓟宾对TB药物治疗引起的肝肾功能具有保护作用。石清红等［17］发现水飞蓟素中的水飞蓟宾具有稳定肝细胞膜、促进肝细胞再生等作用，且能降低抗结核药物治疗期间肝损伤的发生风险。DE OLIVEIRA等［18］发现，水飞蓟宾中的类黄酮羟基酚类组分可干扰、降解大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌等革兰阴性菌的细菌酶（如DNA拓扑异构酶）活性发挥抗菌作用。另外，水飞蓟宾不仅对巨噬细胞向泡沫细胞转化有抑制作用，还可抑制MIP-2表达发挥抗巨噬细胞凋亡作用［19］。近来研究发现，水飞蓟宾也可抑制耐药菌株Mtb的生存，提示水飞蓟宾可能为治疗结核病的潜在药物［7］。本研究发现，给予水飞蓟宾干预治疗后，大鼠肺组织巨噬细胞凋亡、Mtb感染及肺组织炎症损伤现象均得到明显缓解，证实水飞蓟宾对改善TB肺组织损伤有一定的治疗作用。本研究对其促进巨噬细胞存活的分子调控途径进行进一步探究。

Fas/FasL信号通路是介导巨噬细胞凋亡的关键通路。大量研究发现，Fas/FasL可介导caspase8/3信号通路或不依赖caspase的线粒体凋亡诱导因子（AIF）/核酸内切酶G（EndoG）信号通路，诱导小鼠和人巨噬细胞凋亡［20］。DU等［21］认为病原体表面的外膜蛋白（OMP）及脂多糖（LPS）中，很可能存在促进Fas/FasL及caspase8/3信号凋亡途径活化的FasL样蛋白成分，而使内吞作用被抑制的巨噬细胞在被病原体感染后仍会发生凋亡现象。REX等［22］发现LPS刺激巨噬细胞释放IL-6及TNF-α的过程中，也会诱导巨噬细胞Fas表达与膜转位，促进Fas/FasL依赖的caspase8/3信号活化，介导全身凋亡信号活化。另外，病原体感染巨噬细胞过程中，刺激巨噬细胞释放的MIP-2也可激活Fas/FasL及caspase8/3信号凋亡途径活化，进而介导组织细胞及巨噬细胞损伤及凋亡［23］。本研究发现，TB模型大鼠肺组织中MIP-2表达升高的同时，Fas/FasL及caspase8/3凋亡信号蛋白表达也明显升高，上调大鼠机体Fas表达进一步促进Fas/FasL及caspase8/3凋亡信号活化的同时，大鼠肺组织炎症损伤、Mtb感染及巨噬细胞凋亡进一步加重，提示Fas/FasL及caspase8/3凋亡信号活化可能参与Mtb感染引起的肺组织炎症损伤、巨噬细胞凋亡过程。已有研究发现，水飞蓟宾对肝组织Fas/FasL凋亡信号活化有抑制作用。本研究发现，水飞蓟宾改善大鼠肺组织巨噬细胞凋亡、Mtb感染及肺组织炎症损伤的同时，Fas/FasL及caspase8/3凋亡信号也处于抑制状态，提示水飞蓟宾可能通过抑制Fas/FasL及caspase8/3凋亡信号活化，抵抗Mtb感染引起的肺组织巨噬细胞凋亡及炎症损伤作用。Fas过表达可部分减弱水飞蓟宾的抗Mtb感染、抗肺组织巨噬细胞凋亡、抗肺组织炎症损伤作用。

综上所述，水飞蓟宾可能通过抑制Fas/FasL凋亡信号激活，发挥抗Mtb感染、抗肺组织巨噬细胞凋亡及抗肺炎症损伤作用，但水飞蓟宾与Fas的调控作用是直接的还是间接的还需更加深入的研究。此外，Mtb外膜或巨噬细胞表面，可能都含有Fas活性成分，水飞蓟宾抑制Fas/FasL信号活化作用与抑制Mtb外膜还是抑制巨噬细胞表面的Fas活性成分有关也尚不明确，有待后续研究。