体外产气法评定茶渣替代苜蓿的可行性研究

2024-01-24牛歆然吴文旋陈鑫珠茅慧玲

饲料工业 2024年1期

■ 牛歆然杨艺吴文旋* 陈鑫珠王翀茅慧玲朱雯

（1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，动物科学学院，动物营养与饲料科学研究所，新农村发展研究院，贵州省山地畜禽养殖污染控制与资源化技术工程实验室，贵州贵阳 550025；2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州 350013；3.浙江农林大学动物科学学院，浙江杭州 311300；4.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036）

苜蓿属豆科牧草，适口性好、营养平衡、饲用价值高，是反刍动物的优质粗饲料，被称为牧草之王。近年来，我国牛羊产业发展迅速，对苜蓿等优质蛋白牧草需求持续增加；但受温度、土地面积及土壤肥力等的限制，苜蓿生产规模和产量长期难以满足需求，催生了可以替代苜蓿的高蛋白质水平饲料原料开发利用研究[1]。开发利用茶渣对缓解我国优质牧草短缺具有重要意义。茶叶富含利于身体健康的茶氨酸、茶多糖、茶蛋白等养分，在国内广泛种植[2]。据报道，我国干毛茶产量在2018 年已达216.6 万吨，加工企业将这些茶叶加工成饮料及其他保健品可产生100 万吨茶渣[3]。前人研究表明，茶渣仍含有大量养分[4]，是不可多得的宝贵资源。按干物质基础算，茶渣含蛋白质16.9%～31.7%[5]、粗纤维17.56%～25.20%、中性洗涤纤维60.8%、酸性洗涤纤维36.27%[6]。其中，茶渣纤维可维持反刍动物瘤胃内环境稳定，减少瘤胃内酸性物质堆积[7]；茶多酚作为天然抗氧化剂，可与自由基反应终止其连锁反应，抑制动物机体内脂质过氧化[8]；茶渣单宁和皂苷可降低反刍动物瘤胃内甲烷产生量[9]。与苜蓿相比，茶渣的成本偏低，价格优势明显，对提高养殖效益作用明显。结合茶渣上述优点，尤其是其蛋白质水平与苜蓿相近的优势，可以考虑利用其替代苜蓿蛋白，降低家畜饲养成本，拓宽饲草资源。瘤胃发酵内环境稳定对提高反刍动物饲粮利用率和提高营养物质吸收有重要意义，但关于茶渣瘤胃体外发酵的研究报道较少。鉴于此，本试验以肉羊为试验动物，比较苜蓿与茶渣的瘤胃体外发酵参数，为将茶渣开发成为肉羊非常规蛋白质饲料原料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲粮

选取4 只体况良好、体重接近[（33.45±2.39） kg]的贵州黑山羊为瘤胃液供体羊，单饲于独立代谢笼中。肉羊饲粮精粗比为40∶60，按略高于维持需要水平配制，由精料颗粒料与苜蓿干草组成，饲粮结构及营养水平见表1。

表1 肉羊基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.2 饲养管理

肉羊每天09:00、18:00 饲喂两次，自由饮水。持续饲喂基础饲粮15 d 后，在第16 天晨饲前使用胃管式瘤胃液采样器（VP30，北京莱伯科泰仪器股份有限公司）通过口腔抽取供体羊瘤胃液，经4 层纱布过滤后装入提前通入CO2的恒温（39 ℃）保温瓶内保存，送入实验室进行体外发酵试验。

1.3 体外产气

参照本课题组前期积累，体外产气利用ANKOM RFS 产气测量系统测定[10]，产气瓶体外发酵模块随机分为3组（空白组、苜蓿组、茶渣组），每组8个重复，每个重复1 个产气模块。空白组不添加发酵底物，苜蓿组、茶渣组分别向每个产气模块瓶中添加苜蓿草粉、茶渣粉4.000 g，茶渣及苜蓿营养水平见表2。

表2 茶渣与苜蓿营养成分对比（干物质基础）

每个发酵瓶中加入人工瘤胃液（80 mL 人工唾液、20 mL 瘤胃原液），迅速通入事先充入CO2的发酵模块瓶后放入卧式恒温振荡器（HNY-211B，天津欧诺仪器股份有限公司）进行体外发酵，设定温度为39 ℃，转速60 r/min，发酵时间持续48 h。

1.4 人工唾液配制

① 常量元素溶液：在烧杯中加入5.7 g 无水磷酸氢二钠、6.2 g 无水磷酸二氢钾、0.6 g 七水合硫酸镁，用纯化水溶解后定容至1 L。

② 微量元素溶液：在烧杯中加入13.2 g二水合氯化钙、10 g 四水合氯化锰、1 g 六水合氯化钴、8 g 六水合三氯化铁，用纯化水溶解后定容至100 mL。

③ 体内缓冲溶液：在烧杯中加入4 g 碳酸氢铵、35 g碳酸氢钠，用纯化水溶解后定容至1 L。

④ 还原剂溶液：在烧杯中加入0.625 gL-半胱氨酸盐酸盐一水物、4 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液、0.625 g九水合硫化钠，用纯化水溶解后定容至100 mL。

⑤ 刃天青溶液：将0.1 g 刃天青溶解后定容至100 mL。

⑥ 人工唾液：将2 g 胰蛋白酶用400 mL 纯化水溶解，加入1 mL 微量元素、200 mL 体内缓冲溶液、200 mL 常量元素溶液、1 mL 刃天青溶液，混合均匀后通入CO2，39 ℃水浴加热至溶液由蓝紫色变为无色。

1.5 指标检测

1.5.1 体外产气量

① 记录系统显示累计产气压力，计算体外发酵产气量。

式中：GP——39 ℃条件下产生的气体体积（mL）；

Vj——发酵瓶中除去液体部分外的气体所占体积（mL）；

PPsi——ANKOM RFS 产气测量系统记录的累计产气压力（Psi）。

② 产气参数

利用SAS 9.2 NINE 程序将样品各时间点的产气量带入Ørskov等（1979）提出的模型中计算产气参数。

式中：GPt——t时刻的累积产气量（mL）；

a——快速降解部分产气量（mL）；

b——慢速降解部分产气量（mL）；

a+b——潜在产气量（mL）；

c——产气速率（%/h）；

t——时间（h）。

1.5.2 瘤胃发酵参数

体外发酵48 h 后终止发酵，用Seven2GoTMpH 计测定发酵液pH。

将每个发酵瓶内瘤胃液分别倒入对应离心管后于4 ℃条件下10 000 r/min 离心10 min，收集上清液，测定氨态氮（NH3-N）浓度、纤维素酶活性、挥发性脂肪酸（VFA）含量。NH3-N 浓度参照参考文献[11]，使用全功能微孔板检测仪（SynergyTMH4，美国博腾仪器有限公司）测定。纤维素酶活性参照《反刍动物营养学研究方法》[12]测定。VFA 含量使用气相色谱仪（GC-2010 Plus，日本岛津）[10]测定。甲烷产量（V甲烷）按照Moss等[13]的方法进行计算。

V甲烷=0.45×乙酸－0.275×丙酸＋0.4×丁酸

将离心管内剩余残渣在65 ℃烘至恒重测定，计算干物质（DM）降解率。

干物质降解率（%）=（发酵底物重-残留底物重）/发酵底物重

参照Menke 等[14]提出的方法，以200 mg 样品（干物质基础）为每单位体外发酵底物时，根据样品体外培养24 h 产气量计算可消化有机物含量（DOM）、有机物降解率（OMD）和代谢能（ME）。

式中：GP24——24 h的累计产气量（mL）；

DOM——可消化有机物含量（g/kg）；

OMD——有机物降解率（%）；

ME——代谢能（MJ/kg）。

1.6 数据统计与分析

数据先用Microsoft Excel 2010 软件进行初步处理，再用SAS 9.2 进行t检验。差异显著性水平定为P<0.05。试验数据以“平均值±标准差（mean±SD）”表示。

2 结果与分析

2.1 产气量与产气参数

由表3 可知，苜蓿组12、24、48 h 累计产气量、慢速发酵部分产气量、潜在产气量均显著高于茶渣组（P<0.05）；两组间快速发酵部分产气量、产气速率并未见显著差异（P>0.05）。

表3 茶渣与苜蓿瘤胃体外发酵产气量、产期参数比较

2.2 瘤胃发酵参数

2.2.1 pH、干物质降解率、NH3-N、DOM、OMD、ME

由表4 可知，经过48 h 发酵后，茶渣组pH 显著低于苜蓿组pH（P<0.05）；茶渣组干物质降解率较对照组提高51.61%，差异显著（P<0.05）；苜蓿组NH3-N 水平高于茶渣组112.83%，差异显著（P<0.05）；根据24 h产气量计算可消化有机物、有机物降解率、代谢能，苜蓿组均显著高于茶渣组（P<0.05）。

表4 茶渣与苜蓿瘤胃体外发酵参数比较

2.2.2 挥发性脂肪酸和纤维素酶活

由表5 可知，两组总挥发性脂肪酸、乙酸、甲烷产量和乙酸/丙酸差异不显著（P>0.05），但苜蓿组丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸分别较茶渣组高40.39%、69.63%、25.69%、69.46%、91.51%，差异显著（P<0.05）。苜蓿组木聚糖酶活性较茶渣组高18.11%，差异显著（P<0.05）；羧甲基纤维素酶活性、β-葡萄糖苷酶活性两组接近，差异不显著（P>0.05）。

表5 茶渣与苜蓿瘤胃体外发酵挥发性脂肪酸和纤维素酶活比较

3 讨论

3.1 茶渣与苜蓿的肉羊瘤胃体外发酵产气量比较

瘤胃体外发酵产气量与瘤胃微生物活性有关，可体现发酵底物在瘤胃中的可利用程度，是评价反刍动物饲料原料饲用价值的重要手段[15]。本试验中，在体外发酵12～48 h，茶渣组体外发酵产气量均显著低于苜蓿组；深入分析发现，随着发酵时间的延长，两者产气量差值逐渐增大，且苜蓿体外发酵时潜在产气量也高于茶渣。产生这一结果与本试验所用的原料特性有关。一般来说，用作饲料的茶渣多为秋梢茶，多由比较粗老的叶片、茶梗等组成，纤维含量高（试验测定NDF 为62.40%），消化利用率不高；茶渣原料的老嫩程度与其营养成分含量密切相关，秋梢的茶蛋白质含量为16.90%～24.20%，水解氨基酸总量也较低[16]，营养价值不占优势。而本试验所用的苜蓿为牧草之王，其NDF 含量为34.7%，纤维消化率可达80%，蛋白含量最高可达28.07%，相对饲喂价值与鱼粉相当[17]，综合营养价值高于茶渣。

根据康乃尔净碳水化合物-蛋白质体系(CNCPS)体系，糖类、有机酸、低聚糖和非蛋白氮可以在瘤胃中被快速降解，木质素、细胞壁和与其结合的蛋白质在瘤胃中降解速度缓慢[18]。在本试验中，两组间快速发酵部分产气量并未见显著差异，这说明茶渣与苜蓿中易于降解的葡萄糖、淀粉等营养物质含量相似，但茶渣细胞壁纤维与苜蓿相比更难被瘤胃微生物利用。两组间体外发酵产气速率差异不显著，这表明瘤胃中微生物的活性相差不大，饲料中能量与氮的平衡也没有差异[19]。

3.2 茶渣与苜蓿的肉羊瘤胃体外发酵参数比较

3.2.1 pH、干物质降解率、NH3-N、DOM、OMD、ME

瘤胃是反刍动物的特有器官，瘤胃pH 对反刍动物健康至关重要，可通过影响内环境稳态而改变瘤胃微生物活性[20]。有研究报道，在山羊饲粮中添加茶叶提取物不会影响其瘤胃中干物质、粗蛋白、NDF 和酸性洗涤纤维（ADF）的降解率，也不会使试验羊瘤胃液的pH、氨态氮和挥发性脂肪酸等指标产生变化[21]。本试验中，两组pH 虽有统计学显著差异，但数值相差很小（0.02），说明添加茶渣并不会通过改变瘤胃内pH对反刍动物消化能力产生影响，这与Magalhães 等[22]的研究结论相符。Nasehi 等[23]研究表明，茶渣替代部分苜蓿并未对肉羊体内发酵瘤胃液pH 产生影响。Knodo等[24]以红茶渣和绿茶渣为发酵底物并添加单宁进行的体外发酵试验也得到类似结论。

干物质降解率可反映饲粮养分在动物体内消化吸收程度，二者呈正相关关系。干物质降解率高，意味着机体获得的营养物质相对较多[25]。前人研究表明，DMD与GP呈正比例相关[26]，高饲粮蛋白质水平可通过提高瘤胃微生物的活性提高DMD[27]。这与本试验结果不相符，因为苜蓿GP 水平高于茶渣，而茶渣干物质降解率高于苜蓿，其原因有待进一步研究。由茶渣体外发酵48 h后干物质降解率可以推测，瘤胃微生物对茶渣养分的利用水平高于苜蓿。这提示，在体外发酵试验进行至48 h时，茶渣在瘤胃内被微生物利用的程度有所提高，提示其具有作为肉羊饲料资源的潜力。这与张相伦等[28]的试验结论一致。

DOM、OMD 与ME 能够衡量饲粮的利用价值，本试验中三个指标均为通过24 h产气量估测值，根据计算公式可知，24 h 茶渣组产气量低于苜蓿组，且DOM、OMD 与ME 与产气量成正比例关系，茶渣组数值均低于苜蓿组。根据NRC 肉羊营养需求可知，苜蓿ME 约为8.57 MJ/kg，与计算值相比偏低，这说明苜蓿与茶渣均不适合作为单一饲料饲喂肉羊。

氨态氮是饲粮中各种含氮化合物在瘤胃中降解的主要产物，是合成菌体蛋白的重要底物，有效浓度为5～30 mg/dL[29]。当瘤胃中NH3-N 和能量比例不匹配时，NH3-N 用于瘤胃微生物合成蛋白质的效率就低。若NH3-N浓度低于正常范围，会降低纤维素在瘤胃内的分解效率；反之则会造成瘤胃发酵过程中氮的损失，使反刍动物的饲料转化率和日增重降低[30]；若NH3-N 浓度持续增加，可能会导致瘤胃氨中毒[31]。本试验中，虽然苜蓿和茶渣的NH3-N 含量差异显著，但均处于正常范围内，提示茶渣有作为反刍动物饲粮开发利用的营养价值。同时，茶渣体外发酵后的NH3-N含量较苜蓿低，说明其NH3-N 利用率得到提高，减少了氮损失。前人有类似结论的报道，浓度为8 mg/dL时瘤胃微生物生长速率最大[32]，这说明茶渣中的含氮化合物和苜蓿中含氮化合物具有类似的生物学价值，可作为肉羊的潜在饲料资源。

3.2.2 挥发性脂肪酸

瘤胃挥发性脂肪酸的含量是评定其发酵水平的重要指标，也是反刍动物的主要能量来源[33]，主要由乙酸、丙酸提供。其中，乙酸主要为机体供应能量，丙酸是葡萄糖合成的主要前体物质。乙酸/丙酸值与瘤胃中饲粮的发酵类型有关[34]，当乙酸/丙酸值大于3.5时，瘤胃表现为乙酸型发酵[35]。本试验结果表明，苜蓿与茶渣的乙酸/丙酸值均大于3.6，这可能与茶渣和苜蓿都属于非结构性碳水化合物相关。异丁酸、异戊酸等支链氨基酸的降解产物可在瘤胃微生物的作用下重新合成支链氨基酸，并为纤维分解菌生长提供营养因子[36]。瘤胃分解利用纤维素和半纤维素时会产生H2与CO2，微生物可以利用这些气体与能量生成CH4或挥发性脂肪酸（VFA）[37]，瘤胃发酵中大量产生的CH4，不仅会降低反刍动物的能量利用效率，对环境也有不良影响[38]。本试验中，茶渣组总挥发性脂肪酸（TVFA）与CH4含量均少于苜蓿组，这可能是茶渣中具有抗菌作用的生物活性物质抑制甲烷产生[39]。

茶渣组与苜蓿组的乙酸水平并无显著差异，但茶渣组丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸以及戊酸含量均较苜蓿组显著降低，这可能说明瘤胃发酵过程中茶渣所提供能量少于苜蓿，也可能是茶渣为发酵底物时可促进瘤胃液内微生物活动，从而消耗挥发性脂肪酸以维持供能，因此茶渣组多项挥发性脂肪酸含量均低于苜蓿组。

3.3 纤维素酶活性

瘤胃中的纤维素酶主要包括羧甲基纤维素酶、木聚糖纤维素酶和微晶纤维素酶等，这些酶谱通过组合活性降解纤维素[40]，因此常通过测定瘤胃内纤维素酶的活性反映瘤胃微生物利用饲粮转化为营养物质的能力。羧甲基纤维素酶活性反映该酶降解水溶性纤维素衍生物的能力。木聚糖酶是一组能够水解木聚糖的酶类，因为木聚糖是最主要的植物半纤维素成分，因此该酶的活性大小也反映了瘤胃内植物组织中半纤维素的消失程度。β-葡糖苷酶是微晶纤维素酶中的一类，可协同其他纤维素酶将饲粮中糖类物质降解为葡萄糖。在本试验中，β-葡糖苷酶、羧甲基纤维素酶活性均未受底物影响产生显著差异，茶渣组木聚糖酶活性显著低于苜蓿组，但数值差异并不大。这一现象可能与酶类在机体中参与反应时的相互作用有关，推测茶渣在作为体外发酵底物时并不会对瘤胃内各种纤维分解菌的活性产生影响，也反映了其可作为肉羊饲料资源。

以上结果表明，以纯苜蓿和纯茶渣为发酵底物进行体外发酵时，苜蓿的可利用程度高于茶渣。