陈皮体外预处理对柑橘黄酮含量和感官指标的影响

■ 葛冬冬 陈 静 李海东 刘显军* 杨馥嘉

（1.沈阳农业大学动物科学与医学学院，辽宁沈阳 110866；2.沈阳博睿农牧科技有限公司，辽宁沈阳 110300）

“替抗”已经成为饲料工业的研究热点，其中中草药饲料添加剂具有绿色、无污染、无残留等多种优势，成为重点研究方向之一。陈皮为芸香科植物柑橘（Citrus reticulataBlanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮，作为一味传统的中草药，具有理气健脾、燥湿化痰的功效。现代研究表明，其主要活性成分黄酮类、挥发油类、生物碱类等物质具有促进胃肠蠕动和消化液分泌、调节血压、减缓咳喘、提升免疫力、抗氧化、抗病原微生物及病原虫等多种生物活性[1-5]。陈皮味苦，在畜牧生产中直接饲喂适口性较差，国内鲜有将其直接作为饲料直接饲喂畜禽，但巴西等美洲地区有将柑橘加工副产物饲喂动物的先例，故将陈皮开发为中草药饲料添加剂具有一定应用前景。柑橘中的黄酮类物质（以下称柑橘黄酮）是陈皮的主要活性成分，直接饲喂吸收效果较差，提高柑橘黄酮含量成为陈皮开发的重点[6]。同时研究表明，陈皮中的柠檬苦素类成分是陈皮苦味的主要来源，对于陈皮适口性也同样有重要影响[7]。本试验通过菌发酵、酶解、菌酶协同三种体外预处理方法对陈皮进行处理，以其主要活性成分柑橘黄酮作为衡量指标，筛选出陈皮体外预处理的最佳方法和条件，同时对比处理前后的适口性，为陈皮作为新型中草药饲料添加剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验添加剂

陈皮购自安徽亳州同仁堂，打粉过筛，黄酮含量为1.97%；枯草芽孢杆菌购自兴盛旺生物科技公司，活菌数≥1×1011CFU/g；复合酶（纤维素酶、果胶酶之比为1∶1），均购自于河南万邦化工科技有限公司，其中纤维素酶活性≥1×104U/g，果胶酶活性≥6×104U/g。

1.2 试验方法

1.2.1 陈皮菌酶协同处理工艺流程

陈皮→添加菌与酶→加水混匀→发酵袋密封→37 ℃发酵→烘干粉碎→成品。

1.2.2 测定指标

柑橘黄酮含量测定：选择黄酮类物质测定常用的亚硝酸钠-硝酸铝比色法[8]，以芦丁质量浓度为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线，计算黄酮含量。

式中：m——芦丁质量（mg）；

M——样品质量（g）；

V1——样品体积（mL）；

V2——测定体积（mL）[9]。

1.2.3 菌发酵处理

枯草芽孢杆菌采用3×3×3正交试验设计（见表1），发酵时间设置3 个水平（3、5、7 d），料液比设置3 个水平（10∶6、10∶7、10∶8），菌添加量设置3 个水平（3%、5%、7%），共9个处理，每个处理重复3次。研究发酵时间、料液比、菌添加量对陈皮中柑橘黄酮含量的影响。

表1 L9(34)菌发酵正交试验因素水平

1.2.4 酶解处理

复合酶采用分别以时间和加酶量为因变量的单因素试验设计，酶解时间设置3 个水平（3、5、7 d），酶添加量设置3 个水平（0.3%、0.5%、0.7%），共6 个处理，每个处理重复3 次。研究酶解时间、酶添加量对陈皮中柑橘黄酮含量的影响。

1.2.5 菌酶协同处理

菌酶协同采用3×3×3 正交试验设计，菌添加量设置3 个水平（3%、5%、7%），酶添加量设置3 个水平（0.3%、0.5%、0.7%），料液比设置3 个水平（10∶6、10∶7、10∶8），共9个处理，每个处理重复3次。研究菌添加量、酶添加量、料液比对陈皮中柑橘黄酮含量的影响，见表2。

表2 L9(34)菌酶协同正交试验因素水平

1.2.6 感官评价

感官评价：根据国家团体标准T/CSWSL 002—2018，在试验前后，参考龙勇等[10]试验中的感官评价方法，从色泽、气味、质地三方面对于处理后陈皮进行感官评价。

1.2.7 数据分析

试验数据经Excel 软件整理后，采用SPSS 26.0软件中的一般线性模型单变量进行分析。采用Duncan’s 法进行多重比较，P<0.05 表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著。数据结果用“平均值±标准差”表示。在进行有重复正交设计结果分析时，如果模型误差不显著，则对各因素水平进行多重比较，选出各个因素最优水平相组合，得到最优水平组合。如果模型误差显著，说明各因素间存在交互效应，则进行各处理平均数的多重比较，选出最优水平组合。

2 结果与分析

2.1 陈皮菌发酵处理结果

由表3 分析可知，柑橘黄酮提取影响因素大小依次为菌添加量>时间>料液比。

表3 L9(34)菌发酵条件的正交试验结果

由表4 分析可知，时间、料液比、菌添加量对发酵陈皮中柑橘黄酮含量具有极显著影响。结合极差分析和方差分析结果，取最大的处理为最优，即正交最优组合为A1B2C2，即时间3 d、料液比10∶7、菌添加量5%。在此条件下的发酵陈皮，由表3看柑橘黄酮含量为（5.14±0.13）%。

表4 陈皮菌发酵正交试验方差分析

2.2 陈皮酶解处理结果

由表5 分析可知，酶添加量在0.3%～0.5%时，陈皮的柑橘黄酮含量随着酶添加量的上升而提高，在0.5% 时达到最高，为3.43%；酶添加量在0.5%～0.7%时，陈皮的黄酮含量随着酶添加量的上升而降低。

表5 酶添加量水平的单因素试验结果(%)

由表6 分析可知，料液比的影响较酶添加量的影响小，料液比在10∶7 时陈皮的黄酮含量达到最高，为3.38%。

表6 料液比水平的单因素试验结果(%)

2.3 陈皮菌酶协同处理结果

由表7 分析可知，柑橘黄酮提取影响因素大小依次为料液比>菌添加量>酶添加量。

表7 L9(34)菌酶协同条件的正交试验结果

由表8 分析可知，菌添加量对发酵陈皮中柑橘黄酮含量具有显著影响，酶添加量、料液比对发酵陈皮中柑橘黄酮含量具有极显著影响。结合极差分析和方差分析结果，取最大的处理为最优，即正交最优组合为A2B1C2，即菌添加量5%、酶添加量3%、料液比10∶7。在此条件下的发酵陈皮，由表7 看柑橘黄酮含量为（5.15±0.23）%。

表8 陈皮菌酶协同正交试验方差分析

2.4 三种工艺处理结果分析

由表9 可知，菌发酵组和菌酶协同组在最优处理条件下的陈皮中黄酮含量显著高于酶解组（P<0.05），在最优处理条件下陈皮中黄酮含量菌发酵组和菌酶协同组之间差异不显著（P>0.05）。

表9 3种工艺处理的黄酮含量(%)

2.5 处理前后陈皮感官评价结果

在色泽方面，随着处理的进程，陈皮的颜色逐渐加深，由金黄色转变为浅棕色，再转变为深棕色；在气味方面，处理前后的陈皮酸苦味转变为焦香味，但在刚发酵结束时有浓烈的酸味；在质地方面，由发酵前的干燥松散转变为发酵结束时的潮湿粘连，再转变为烘干后的干燥结块。见表10。

表10 陈皮感官评价表

3 讨论

3.1 不同体外预处理方法对于陈皮发酵效果的影响

发酵是中草药的传统炮制方法之一，也是饲料工业中原料的处理工艺之一，具有安全性高、代谢产物丰富、利于规模化生产、质量稳定等多种优点。酶解处理是指直接使用特定的酶制剂进行催化处理，处理效率高、专一性强、期间没有其他干扰反应。菌酶协同发酵饲料是指通过菌发酵和酶解两种方法协同作用发酵饲料，能够提高发酵周期和提升发酵效率，但具体相互作用机理和效果评价还不完善。三种处理方法都能有效处理中草药，提高中草药有效成分的释放，提高畜禽对于有效成分的吸收利用。通常菌酶协同处理的效果优于发酵处理和酶解处理，商子涵等[11]分别以三种方法对中草药饲料添加剂进行处理，结果最佳方法为混合菌（植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌比例1∶9）接种量12%、混合酶（纤维素酶和果胶酶比例3∶7）的菌酶协同处理方法。

本试验中，菌发酵和菌酶协同处理在各自最优条件下，以柑橘黄酮含量为衡量指标，两者的发酵效果差异很小，柑橘黄酮的含量分别为(5.14±0.13)%和（5.15±0.23）%。原因可能是发酵量过少不能使菌酶协同处理的高效率优势拉大，也可能是陈皮本身“陈化”和干燥等性质导致酶解效果不佳，有待后续研究。

3.2 不同体外预处理条件对于陈皮发酵效果的影响

菌种对于发酵环境具有一定要求，在合适的发酵工艺下才能够发挥最好的发酵效果，甚至不适宜的发酵环境还会产生有毒有害物质，故对于发酵工艺的确定也十分重要。程水明等[12]以山楂粉最为基质发酵，结果发酵工艺为温度25 ℃、发酵时间7 d、菌接种量6%及料液比1∶35（g∶mL）时山楂中总黄酮含量最高（42.8%）。本试验中，最佳的发酵工艺为料液比10∶7、菌添加量5%、时间3 d 的枯草芽孢杆菌发酵，此工艺下柑橘黄酮含量为(5.14±0.13)%。

对于酶解处理中草药，虽然更高的酶浓度可以加快酶解速度，但是过高的酶浓度也过多地分解了陈皮中的纤维素类物质，对柑橘黄酮类物质的溶解产生抑制，故根据试验结果，酶添加量选择0.5% 最为适宜[13-14]。

3.3 不同体外预处理工艺对于陈皮感官评价的影响

陈皮感官评价的变化，一定程度上反映了陈皮中成分在处理前后的增减。在颜色方面，处理前后陈皮颜色加深，可能是因为陈皮中的柠檬烯与类胡萝卜素在发酵的过程中发生了分解和转化导致黄色逐渐减少，同时烘干后呈现焦色可能是因为烘干时发生了美拉德反应导致颜色加深[15-16]；在气味方面，香味作为芸香科植物的特征一直存在，但处理后气味变浓可能是因为发酵的过程中挥发性物质被释放，印证了处理可以破坏细胞壁以释放细胞内的营养成分，烘干后的焦香印证了色泽评价中颜色的加深来自美拉德反应，美拉德反应有助于提升适口性和刺激消化[17-18]；在质地方面，可能是因为发酵过程中芸香糖苷类黄酮物质中的苷键断裂产生芸香糖，使得组织状态变黏，烘干后易结块，烘干后粉碎处理变得有必要[19-20]。

4 结论

试验结果表明，菌发酵、酶解、菌酶协同三种处理方法分别使柑橘黄酮含量相较于陈皮原品（柑橘黄酮含量为1.97%）提高160.91%、74.11%和161.42%。本研究通过单因素和正交试验得到陈皮的最佳处理工艺为料液比10∶7、菌添加量5%、时间3 d的菌发酵处理或菌添加量5%、酶添加量3%、料液比10∶7的菌酶协同处理，两种方法的柑橘黄酮含量分别为（5.14±0.13）%和（5.15±0.23）%。此时陈皮处理品的感官上呈现深棕色，并伴有焦香气味。相比于普通陈皮粉，以此种工艺处理后的陈皮既在营养价值上有所提升，又在适口性上更有吸引力，同时工艺流程操作简便，且可大规模处理。本研究开发了陈皮发酵的新工艺，为后续陈皮及其他柑橘科类饲料添加剂在畜禽生产中的应用提供依据。