脑白质损伤动物模型研究进展

王紫月，喻志源，骆翔

脑小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）指各种病因影响脑内小动脉及其远端分支、微动脉、毛细血管、微静脉和小静脉所导致的一系列临床、影像、病理综合征。CSVD影像学上突出表现为腔隙性梗死（lacunar infarction，LI）、腔隙（lacune）、脑白质高信号（white matter hyperintensities，WMH）、血管周围间隙扩大（enlarged perivascular space，EPVS）及脑微出血（cerebral microbleed，CMB）等[1]。其中WMH 在颅脑MRI 上表现为脑白质区域中大小不等的异常信号，在T2WI 和FLAIR 序列为高信号，T1WI序列为等信号或低信号[2]；WMH 的高负担与认知能力下降和痴呆有关[3]，病理主要表现为少突胶质细胞死亡及脱髓鞘改变，其中星形胶质细胞在神经损伤修复及髓鞘再生方面均有重要作用[4]。建立有效的动物模型是研究脑白质损伤的基础。本综述主要关注已报道的诱导脑白质损伤的技术，包括其实验动物选择、建模方法及优点和局限性，旨在为脑白质损伤相关基础研究提供基础性资料。

1 动物种类选择

1.1 啮齿类动物

啮齿类动物是脑白质损伤研究中最常见的模型动物，其优点包括体型小、低成本、生存率高、繁殖快、易饲养，有较强抗感染能力且具有稳定的基因特征，可用于研究不同行为学，同时转基因动物在显示疾病机制方面提供了更多的灵活性。

1.2 绵羊

作为脑白质损伤模型中使用最广泛的大型动物，绵羊脑有丰富的脑白质，其中胎羊脑白质损伤的研究多集中在新生儿宫内缺血缺氧或母婴感染上，可以更好的模拟早产儿分娩时缺血缺氧的病理机制。但制作胎羊模型成本高、技术难，需要配备专门的人员和设施[5]。

1.3 非人灵长类动物（non-human primates，NHP）

NHP 在生理、认知能力、神经解剖学、社会复杂性、繁殖和发育等方面与人类具有高度相似性[6]，与人类的遗传物质有75%～98.5%的同源性，被认为是研究人类脑白质损伤最理想的模型。但由于缺乏标准化模型制作方法及神经功能评估方法，涉及高成本、特殊设备及团队，同时要考虑灵长类物种的伦理原则，限制了其在脑白质损伤研究中的使用[7]。此外，家猪等大型动物在临床前研究被广泛使用。啮齿动物脑白质比例仅为10%，而大型动物占比32%，与人脑皮质脑白质的占比45%更接近[8]。

2 造模方法

2.1 局灶性缺血缺氧模型

2.1.1 内皮素1（dndothelin-1，ET-1）注射 ET-1 是由血管内皮细胞产生的一种含21个氨基酸的多肽，是最常用的血管收缩物质之一。ET-1 有2 个同分异构体家族即ET-2 和ET-3，并通过ETA 和ETB 受体发挥作用[9]。立体定位注射ET-1通过强烈的血管收缩作用，引起脑部血流减少和缺氧，引起脑组织的炎性损伤和神经元细胞损伤，导致脑白质损伤的发展。Rodrigues 等[10]将10 pmoL 的ET-1 立体定位注射到大鼠纹状体后，可诱导灰质或白质中精确和可重复的局灶性缺血区域的炎症反应，术后3 h即可出现白质病变，并在7 d内达到最大范围，组织学上存在中性粒细胞募集、轴突损伤及髓鞘进行性损伤等；后Hideaki Ono[11]对此进行技术改进，观察到术后大鼠出现明显的运动障碍。

ET-1诱导脑白质损伤模型已经广泛应用大鼠造模中，但诱导小鼠脑缺血的研究较少。当ET-1 应用于小鼠大脑皮质组织时，其血管收缩能力显著降低，Horie 等[12]通过向多品系小鼠纹状体内微注射1.0 μg ET1 均未引起明显的损伤，随后联合使用ET-1 和L-NAME（一氧化氮和酶抑制剂）增加了小鼠产生梗死的概率，但病变仍然相对较小且具有品系依赖性。研究报道小鼠大脑表达的ETB-R的数量是ETA-R的2倍，ET受体亚型表达的差异可能是ET-1介导的大鼠和小鼠血管收缩差异的原因。

血管收缩剂模型最有益的特征是在白质内预定位置制造高度可重复的病变；但病变发展快速，注射血管收缩化学物质会引起血液供应的急性和剧烈短缺，导致各种白质成分急性和严重死亡，病变发展的突然性使得其更适用于腔隙性梗死，而不是通常以缓慢进展的方式发展的弥漫性白质损伤。

2.1.2 大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO） 大脑中动脉及其分支是人类缺血中最常受损的脑血管，占脑卒中70%以上；该模型[13]于1985年由Koizumi等人首次描述，并于1989年由Longa等人修改；该模型[13]可用于根据可变再灌注时间点建立永久性（p-MCAO）或短暂性（t-MCAO）局灶性脑缺血性卒中，表现为急性缺血导致的供血中断、能量代谢障碍及细胞死亡，完全闭塞超过3 h 会导致供血区域严重缺血性病变，24 h后可见明显的白质疏松，术后7 d内脑白质损伤逐渐加重，存在神经元凋亡、神经炎症和氧化应激等各种病理生理过程[14]，并伴有明显运动和认知功能障碍[15]。该模型对临床上大脑中动脉闭塞卒中患者具有良好的重现作用，操作简单，且可通过调整阻塞位置和时间控制病变的发展，用于缺血再灌注损伤研究；但术后具有一定的死亡率。

2.2 慢性脑低灌注模型

慢性脑低灌注是由于血容量不足、管腔狭窄或者其他原因引起的脑长期供氧不足状态，脑血流动力学与脑白质损伤严重程度具有一定相关性。大鼠双侧颈总动脉闭塞（2-vessel occlusion，2VO）是近年来最为常用的脑白质损伤造模方法，即双侧颈总动脉阻断（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）模型。将双侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）永久结扎，造成脑低灌注状态，使脑组织尤其是易损区域，如脑白质，产生缺血缺氧性损害。相比于沙鼠和大多数小鼠，大鼠是合适的动物模型选择。因其具有完整的Willis 环，在2VO 术后可以通过侧支循环提供不间断（但减少）的血流。研究表明[16]2VO造模后脑血流量（cerebral blood flow，CBF）发生动态变化，CBF在闭塞诱导后立即急剧下降，2～3 d达高峰，最低可至对照组水平的35%～45%；随后逐渐恢复进入慢性期，在4周内仍显著低于对照值；在8 周～3 个月之间，CBF 仅有轻微的减少；在2VO造模6个月后，CBF基本恢复至术前水平，与对照组几乎无法区分。这说明2VO 模型中，即使闭塞是永久性的，CBF 也会在几个月的时间通过代偿和适应性机制恢复正常。在慢性期期间，2VO大鼠的脑低灌注更好地模拟了人类慢性脑低灌注的病理生理过程，但由于急性期CBF 下降剧烈及显著，术后死亡率高。有研究对大鼠进行单侧CCA 闭塞和对侧诱导CCA 狭窄，术后手术组CBF 逐渐减少，且死亡率较低（2.3%），术后14 d 白质变性在胼胝体和纹状体中很明显[16]。

2VO大鼠模型有一些固有的缺点，例如急性缺血损伤眼动脉影响视力从而影响后续行为学评估、大鼠分子技术不成熟影响后续遗传学研究等[17]。因此Shibata等[18]开发了双侧颈总动脉狭窄（bilateral common carotid artery stenosis,BCAS）模型，使用弹簧圈包绕在小鼠双侧CCA 周围减小管腔直径，线圈内径越小，脑血流下降速度越快，同时小鼠因颈总动脉急性收缩而死亡的比例越高，术后CBF缓慢下降，14 d后胼胝体、尾状核和内囊内侧部分出现白质病变，且灰质没有任何组织学异常，并且不损伤视神经。Lee等[19]进一步将10～12周龄载脂蛋白E缺陷小鼠分为接受假手术和BCAS 手术组，术后手术组组织病理学显示弥漫性白质损伤及多发性微梗死，伴有运动功能受损，此模型纳入动脉粥样硬化血管危险因素，更精确地模仿人类脑白质损伤机制及带来的认知障碍。

基于Hattori 等[20]建立的双侧颈总动脉不对称狭窄模型（asymmetrical common carotid artery stenosis，ACAS），Quintana[21]同样通过在小鼠左侧CCA 上使用微弹簧圈诱发约50%的血管狭窄，而在右侧CCA 上使用Ameroid 血管收缩器导致CCA 在28 d 内逐渐闭塞；在该模型中可以观察到CBF 逐渐减少，术后14 d小鼠胼胝体、内囊、海马和尾状核存在多处梗死损伤，后改进为双侧使用0.75 mm血管收缩器缓慢降低脑血流量的渐进颈总动脉狭窄模型（gradual common carotid artery stenosis，GCAS）。该模型不仅避免了2VO 和BCAS 模型急性期CBF 急速下降，并且适用于研究脑白质梗死伴有运动缺陷和痴呆，但相对而言手术过程较复杂。

2.3 高血压靶器官损伤模型

2.3.1 自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）模型及易卒中亚型大鼠模型 SHR是由成年高血压大鼠（Wistar-Kyoto Rat，WKY）进行培育而获得。而自发性高血压易卒中大鼠（spontaneously hypertensive stroke prone rats，SHRSP）则是在SHR大鼠基础上培育的，具有高动脉血压和高卒中发病率。2种模型都是研究遗传性高血压病及高血压导致认知功能损伤的常用动物模型，主要通过长期高血压引起动脉狭窄、硬化、微循环障碍导致慢性缺血状态，随后持续的慢性炎症引起血管壁改变和血脑屏障损伤，进一步加重动脉硬化，形成动脉粥样硬化斑块，导致血管腔狭窄或阻塞，进而引起明显的白质损伤。Daniel Kaiser[22]通过对比WKY和SHR小鼠，证实在SHR模型中存在明显的白质损伤、血脑屏障损伤和脑血管炎症。

研究显示SHR 和SHRSP 均在12 周龄出现高血压，后者在20周龄时出现严重的白质病变；关于自发性高血压大鼠应用于脑白质病变模型的研究很少，研究表明WKY和SHR及SHRSP组间存在遗传差异[23]，因此SHR及SHRSP均缺乏严格的正常血压对照。如果没有饮食控制，SHRSP大鼠将在4～5个月时开始表现出白质的变化，可通过低蛋白和高盐组成的饮食（the Japanese Permissive Diet，JPD）将生存期缩短，加快实验，但可能存在肾脏和大脑器质性损害。Yang 等[24]对SHRSP 小鼠进行单侧颈动脉闭塞手术并予以JPD建立了脑白质损伤动物模型，术后4周MRI显示弥漫性白质损伤伴随血脑屏障通透性增加，且表现出缓慢进展空间学习和工作记忆受损。以上模型[25]较好地模拟了高血压和慢性脑低灌注共同引起的早期脑小血管病理学改变和白质损伤，但其潜在的缺点是实验动物在饮食调整后4 周内自然死亡，无法获得足够数量的白质病变。

2.3.2 易卒中型肾血管性高血压模型（stroke prone renovascular hypertensive rat，RHRSP） RHRSP模型是一种独立于遗传缺陷的获得性高血压动物模型，于1998年由我国科学家曾进团队[26]采用环形银夹夹毕双侧肾动脉后诱导建立，造模后所有RHRSP小鼠均产生高血压。Fan等[27]对大鼠采用双肾两夹法建模后，手术组20周时收缩压显著高于对照组，且MRI显示弥漫性、融合的白质高信号，主要见于胼胝体和外囊区域；病理检查显示明显白质稀疏、髓鞘和神经纤维消失、白质中形成液泡，水迷宫实验显现出明显下降的空间学习和认知能力。

RHRSP是肾血管性高血压自发发展的脑白质损伤，相比于SHRSP，RHRSP 具有无遗传缺陷的优势[28]，但肾动脉夹闭和白质病变发展之间的时间间隔不可预测，并非所有动物在实验的最后时间点都会发生脑白质损伤，一些动物在确定的终点之前表现出严重的病变导致自发死亡；由此Lin 等[29]将改良2VO 模型与RHRSP相结合，提高了模型的稳定性，并导致更广泛的白质病变。

2.3.3 大型动物高血压模型 高血压研究中最常用的大型动物是猪、非人灵长类动物、绵羊，以及狗等，可通过注射血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）或高盐饮食诱导高血压；此外手术诱导高血压相对简单，应用广泛，耐受性良好，手术相关死亡风险低[30]；可通过将猴子的胸主动脉缩窄至2.0～2.5 mm（75%～80%）成功诱导反射性高血压，收缩压＞180/110 mmHg，病理学上可见明显的灰质和白质微梗死，伴有神经元完全丧失及髓鞘纤维丧失等；认知能力下降和微梗死的发病率随着时间的推移而进展[31]。

高血压动物模型，整合了潜在的血管危险因素，更加贴近人类高血压引起的血管进行性狭窄导致的脑白质病变，且生存期较长，可以长期观察高血压对脑白质慢性、持续性影响；但模型建立和繁殖相对复杂，耗时长，＜12 周龄很少出现明显白质损伤灶；高血压的发展和影响因素较为复杂，研究结果的解释较为困难；其次脑白质损伤的病灶较为分散，难以准确定位和定量分析。

2.4 转基因模型

皮质下梗死伴白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病（cerebral autosomal dominant arteriopathy with sub-cortical infarct and leukoencephalopathy，CADASIL）是常见的遗传性脑小动脉病。具有常染色体显性遗传特点，致病基因为位于19号染色体上的Notch3 单基因，该病通常于中年起病，表现为偏头痛、脑白质病、多发性脑梗死和认知障碍且伴有精神症状，呈进行性加重。电镜检查可以发现微小动脉平滑肌细胞表面出现嗜锇酸物质（granular osmiophilic material，GOM），病理学可概括为系统性小动脉病变、多发腔隙性梗死和广泛白质脱髓鞘[32]。

Notch3 基因突变导致血管平滑肌细胞增殖且分泌基质蛋白增多，伴随血小板凝聚和纤维蛋白沉积进而引起微血管管腔狭窄和闭塞，导致白质损伤，可以模拟非高血压缺血性CSVD的遗传现象。Joutel等[33]将携带Notch3突变的基因组片段通过导入PAC（P1-derived artificial chromosome）载体转基因进入小鼠体内开发了具有R169C 点突变的CADASIL 小鼠模型，后续观察中可见GOM沉积（5月龄）、脑血流量减少（约11～12月龄）和进行性广泛白质损伤（约18～20 月龄）。Ayata 等[34]对4 种CADASIL突变小鼠模型常采用的突变基因做了总结，具有最高水平转基因表达的R169C 突变体中确实发生了明显的脑白质损伤，而R90C 和C428S 突变体中尽管有突出的血管病理学和功能障碍，但没有类似于CADASIL的脑实质病变；R142C敲入小鼠则没有出现任何解剖学异常。该模型可以特异地着眼于CADASIL，但缺点在于除病理生理学及解剖学异常，很少有报告存在显著的认知和运动障碍；且由于其遗传特异性，无法涵盖其他的脑白质病变类型。

2.5 药物损伤模型

3-硝基丙酸（3-Nitropropanoic acid，3-NPA）是一种线粒体毒素，它不可逆的抑制琥珀酸脱氢酶活性（复合体Ⅱ）和三羧酸循环，破坏氧化代谢，目前广泛用于亨廷顿舞蹈症动物模型中，产生类似的神经紊乱和线粒体损伤的改变[35]。但这种化学性缺血损伤与局部灌注不足模型相似，全身注射后，24 h 内纹状体神经元丢失、少突胶质细胞受损、脱髓鞘改变并有纹状体和皮质下白质轴突损伤；术后动物后肢出现肌张力障碍，较高剂量时出现瘫痪，在被动回避测试中存在认知缺陷[36]。该模型通过调整3-NPA的剂量快速诱导白质损伤，操作简单；但其病变区域主要集中在纹状体区域，病理过程与人类白质损伤机制不完全相符，在实验过程中由于3-NPA的神经毒性作用，对操作者自身安全存在一定威胁。

3 总结

迄今为止，对可以复制人类脑白质损伤的动物模型的研究仍然有限，其中小动物模型在分子和细胞机制研究方面具有一定的优势，而大型动物模型在病理生理学和临床转化研究方面具有独特的优势；但大多数实验动物研究仅限于啮齿动物，虽然啮齿动物毛细血管确实与人类相似，但与人类在皮质下区域的深层穿支动脉几乎没有相似之处，而这些动脉经常与脑白质损伤有关。

本综述中，我们介绍了各种可操作的脑白质损伤动物模型，不管选用何种动物及造模方法，各种动物模型病理生理的改变不能完全模拟和反映临床脑白质损伤的特征[37]，为了使研究成果尽可能真实地反映其病理生理过程，模型的选择应取决于所提出的研究问题。希望本综述将帮助正在研究脑白质病变的研究者选择最合适的动物模型，并解决研究问题。