“细胞间对话囊泡”外泌体在椎间盘退变治疗中的研究进展*

王君坦, 张宇坤

华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科医院,武汉 430022

下腰痛(lower back pain,LBP)是一种世界范围内常见的慢性疼痛性疾病,好发于体力劳动者以及长期久坐办公人群。据不完全统计,全世界多达80%人群均遭受过不同程度的LBP症状,然而现有LBP的治疗效果却差强人意[1]。脊柱系统作为人体最重要的支撑系统,椎间盘组织起到了缓冲人体载荷的重要功能,是人体骨骼肌肉系统中重要一环。研究发现,LBP症状与腰椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)息息相关。椎间盘由中央髓核(nucleus pulposus,NP)、四周纤维环以及上下软骨终板组织构成。IDD的病理特征主要表现为髓核细胞(NPC)减少和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解[2]。其中,髓核ECM是维持椎间盘弹性和功能的主要成分,其降解是IDD的主要病理特征之一。ECM的主要组分包括Ⅱ型胶原蛋白(collagen Ⅱ)和蛋白聚糖(aggrecan)。ECM的减少既包括合成减少亦包括分解增加,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)MMP-3和MMP-13在ECM降解中起到了重要作用,这也是椎间盘退行性改变的重要标志物[3]。目前治疗IDD的方法有限,多以手术清除病灶、药物治疗缓解疼痛为主,尚没有能够减轻IDD进程的有效药物。因此,寻找减缓IDD进展,甚至逆转IDD进程的治疗方式,成为目前脊柱退行性疾病领域的研究热点[4]。

外泌体是一种纳米级细胞外脂质双层囊泡,在生理及病理条件下几乎所有细胞均可分泌,其直径大约30～150 nm,密度1.13～1.19 g/mL;不同细胞来源的外泌体大小略有差异,也是其后期筛选的重要标志之一。初期研究认为外泌体只是被人体细胞舍弃的细胞外成分,后期研究发现,外泌体广泛存在于人体的各个部位。外泌体呈扁平状,内部包含核酸、蛋白质、脂质等生物大分子,既可以通过血浆远处运输,也可以在相邻细胞间互相作用,对于细胞间交流以及维持细胞的蛋白质及脂质的平衡都具有重要的意义[5]。目前研究表明,外泌体有抑制细胞凋亡、抗衰老、促进增殖、抑制炎性反应的作用,同时还能促进干细胞向特定方向分化,其功能差异由其内含物决定。而外泌体的外双层脂质能够有效保护其内容物免受补体或巨噬细胞的清除,保证了外泌体内环境的稳定性。因此改变或者重塑外泌体内容物成了外泌体研究的热点,也是外泌体临床应用的关键步骤之一。

随着表观遗传学、再生医学和组织工程学研究的深入,细胞外囊泡——外泌体作为IDD治疗的一种潜在手段被科研人员寄予厚望[6]。作为一种包含核酸、蛋白质、脂质等物质的磷脂双分子层膜结构细胞外囊泡,外泌体的来源不具特异性,几乎所有的细胞均可分泌外泌体[7],但目前以髓核间充质干细胞、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells,AMSCs)来源的外泌体最为常见。同时,外泌体具有低免疫原性,不同来源的外泌体不会被机体免疫系统破坏清除[8],此特性也为外泌体治疗IDD的临床应用提供了巨大的潜力。本文将综合分析外泌体研究在椎间盘退变领域的最新动态,对不同细胞来源外泌体的功能进行综述,以期为后续外泌体研究及外泌体治疗IDD的临床应用提供参考。

1 外泌体的生物学来源

外泌体的产生以及分泌后被相关靶细胞摄取的机制尚不完全明确。目前的研究表明,外泌体来源于腔内囊泡。在高尔基复合体和溶酶体的作用下,多囊泡体通过依赖ESCRT(endosomal sorting complexes required for transport)途径和非依赖ESCRT途径内折形成腔内囊泡(intraluminal vesicles,ILVs),多囊泡体携带内部ILVs抵达质膜后,与质膜融合释放出内部ILVs于细胞外形成外泌体[9]。研究发现,肌动蛋白细胞骨架调节蛋白-皮质素在调节外泌体分泌中扮演了重要角色,皮质素、Rab27a和coronin 1b共同调节多泡晚期内体中皮质肌动蛋白对接位点的稳定性,此过程被认为对外泌体的分泌起到了重要的调节作用。外泌体被靶细胞摄取主要通过3种方式:受体配体相互作用、直接膜融合和内吞作用,根据机体器官类型、炎性状况以及靶细胞不同,摄取方式也存在很大差异[10-14]。

由于外泌体大小、质量、密度和沉降力等有所不同,目前外泌体的提取方法主要包括超速离心法、聚合物沉淀法和梯度离心法。在外泌体的鉴定方面,通常使用电子显微镜、纳米粒子追踪分析(nanoparticle trafficking analysis,NTA)、流式分析(flow cytometric analysis)、免疫印迹(Western blot,WB)等方法对外泌体的形态、数量、粒径和标志物进行鉴定[15];在进行流式及WB鉴定时,常用CD90、CD105、CD73,、CD34、TSG101、ALIX、CD63、CD9、HSP70等分子作为标志物进行分析[16]。虽然外泌体分离及鉴定技术已逐渐成熟,但如何快速、有效、大量、高纯度地制备特定外泌体以用于临床疾病的治疗,仍需进一步研究。

2 外泌体在缓解IDD进程中的作用及机制

作为细胞间交流的有效物质,外泌体内容物的多样性影响着外泌体功能的多样性,调节着细胞从核酸复制、转录到蛋白质合成、修饰等众多细胞功能事件。外泌体磷脂双分子层膜结构的稳定性保证其内容物在运输过程中不易被破坏[17],从而确保了外泌体在细胞中发挥作用的有效性和及时性。外泌体结构的简单性与稳定性,为“工程化”外泌体在临床中的广泛应用提供了可能。

随着社会人口的老龄化,LBP在社会人群中的负面影响越来越引起重视。IDD作为LBP的主要病因,其发生机制尚不明确。目前认为,IDD的发病因素主要与衰老、机械因素、化学因素和遗传因素息息相关。椎间盘微环境中的氧化应激和炎症因子等加速了髓核细胞(NPC)凋亡和ECM分解,从而降低了椎间盘结构的稳定性,引起椎间盘突出症、椎管狭窄症等。因此,如何缓解NPC的凋亡、避免ECM降解,成为缓解甚至逆转IDD的关键点[18-19]。本文将结合外泌体的生物学功能及其分子机制,从多角度阐述外泌体对NPC功能的影响,为外泌体在IDD临床治疗中的应用提供参考。

2.1 外泌体抑制NPC氧化应激

氧化应激(oxidative stress,OS)是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态,是导致衰老和疾病的一个重要因素。多项研究表明氧化应激是IDD发生发展的重要因素,能够引起NPC凋亡和炎性因子、MMP等促ECM分解代谢产物的表达和释放增加。细胞凋亡是一种细胞程序性死亡方式,被认为是NPC减少的主要方式之一。线粒体损伤产生的ROS是细胞内源性氧化应激的主要来源,最终引起NPC内源性凋亡和ECM降解。越来越多的研究表明,通过抑制氧化应激可以有效抑制NPC在各种应激条件下的凋亡水平,并在动物模型中缓解IDD进展[20]。Hu等[21]将骨髓间充质干细胞来源的外泌体(BMSCs-Exos)与压力模型SD大鼠的NPC共培养,随后通过CCK-8分析、MDA分析、TUNEL染色、JC-1染色、DCFH-DA分析等发现,随着BMSCs-Exos浓度升高(0、20、50、100 μg/mL),压力模型大鼠退变NPC的细胞活力显著增强;同时,压力诱导的线粒体损伤明显减轻,ROS生成也显著降低。可见BMSCs-Exos能有效减轻压力对NPC的毒性作用,减轻细胞的氧化应激损伤,抑制压力引起的NPC凋亡。

2.2 外泌体抑制NPC内质网应激

内质网(endoplasmic reticulum,ER)是蛋白质合成与折叠的场所,同时也参与维持钙离子平衡。细胞内环境紊乱会导致内质网应激,引起内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡紊乱。新近研究表明,内质网应激与椎间盘退变的发生发展密切相关。Xiang等[22]在健康成年人尿液中挑选出CD29、CD44、CD73阳性的尿源性干细胞(urine-derived stem cells,USCs),并提取出大小在50～100 nm,且CD63和TSG101标志蛋白高表达的外泌体,与压力条件下造模的NPC共培养。结果发现,外泌体共孵育组中内质网应激相关蛋白(GRP78和GRP94)及其相关蛋白表达水平显著下降,内质网应激的凋亡调节因子(CHOP)表达降低,NPC凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-12的表达明显降低。上述结果表明USCs能通过抑制内质网应激有效缓解压力诱导下NPC的凋亡,伴随着未折叠蛋白反应(UPR)的分支蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)的磷酸化水平降低,以及蛋白激酶B(Akt)和细胞信号调节激酶(ERK)的磷酸化水平升高。他们随后对大鼠进行为期0、4、8周的压力造模,同时进行或不进行外泌体注射治疗,最后通过MRI、CT扫描和特征性TOCSY二维光谱检测发现,外泌体的体内注射具有良好的抑制NPC凋亡作用。总的来说,USCs能通过Akt和ERK信号通路来抑制压力诱导下髓核细胞内质网的应激和凋亡,从而在体内有效地减轻椎间盘退变。

2.3 外泌体调节NPC自噬

自噬(autophagy)是一种细胞内重要的分解代谢过程。在炎症、营养缺乏、压力条件下,正常水平的自噬通过降解和回收受损成分、有毒蛋白和细胞器,有助于细胞内质量控制和维持细胞存活。研究发现,增强的自噬流能有效降低细胞IL-6,IL-1β和TNFα的表达和分泌,抑制细胞衰老和凋亡[23]。研究表明,外泌体能够促进自噬流水平,增加P62蛋白的表达[24]。Luo等[25]采用叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,TBHP)进行IDD造模并收集正常软骨终板干细胞(CESC)外泌体与退变软骨终板干细胞外泌体,发现相比于退变组,正常组的CESC外泌体能够通过PI3K/Akt自噬通路显著增强NPC自噬活性,降低NPC凋亡水平。

2.4 外泌体抑制NPC的炎性小体激活

焦亡(pyroptosis)是细胞程序性死亡的一种形式,可被多种炎性小体激活。而炎性小体一旦激活,可导致多种促炎物质,如IL-1β和IL-18等炎性因子不断释放,并影响多种ECM分解代谢酶,如MMP、解聚蛋白样金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTs)的表达,从而促进蛋白聚糖和胶原蛋白的分解代谢,进而影响IDD进程。细胞焦亡过程会伴随着细胞质膜破坏和大量炎性因子分泌,因此抑制细胞焦亡是对抗炎性损伤的重要手段[26]。

Zhang等[27]研究发现,脂多糖可以诱导NLRP3介导的髓核细胞焦亡,同时引起cleaved Caspase-1、IL-18、IL-1β和NLRP3水平显著上升。他们对MSCs与LPS诱导的髓核组织进行共培养后发现,MSCs能有效抑制NPC焦亡进程;当加入GW4869共培养48 h后,MSCs外泌体分泌被抑制,其对NPC焦亡的抑制作用被消除。而进一步研究证实,MSCs外泌体中miRNA-410水平极高,miRNA-410能直接与NLRP3炎性小体结合并抑制其下游信号,从而阻止细胞内焦亡反应,抑制IDD进展。

2.5 外泌体促进干细胞向髓核细胞转化

随着再生医学、干细胞治疗、基因工程研究的不断深入,诱导全能干细胞分化成特定组织细胞,从而治疗组织缺损、组织变异和组织退变等相关疾病,一直是临床医学研究的热点。Zhang等[28]筛选出富含miR-15a的间充质干细胞外泌体,并将其与退变NPC共培养,发现ADAMTS4/5及MMP-3/-13蛋白转录和翻译水平显著下降,伴随着蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白mRNA及蛋白水平显著上升。进一步研究表明,miR-15a可直接通过PI3K/Akt和Wnt3a/β-catenin轴调节MMP-3水平,从而抑制细胞凋亡,促进ECM的生成并抑制ECM降解。他们通过甲苯胺蓝染色证实,miRNA-15a能够促进间充质干细胞软骨分化。Luo等[29]研究发现,软骨终板干细胞源性外泌体在0、20、40 μg/mL水平下与软骨终板干细胞共培养后,趋化因子、SOX9、Ⅱ型胶原蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和Acan的表达水平升高。他们发现外泌体可通过自分泌形式增强软骨终板细胞的侵袭、迁移和分化能力。软骨终板干细胞外泌体可有效提高软骨终板干细胞中HIF-1α水平,通过促进Wnt信号传导、增加GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4,GATA4)及转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)的表达,促进软骨终板干细胞向NPC转化。

2.6 外泌体通过circRNA/miRNA调控IDD

miRNA是一种广泛存在于真核细胞中、长度约为20～24个核苷酸的单链非编码RNA分子,可以调节特定基因的表达水平。miRNA主要是与靶基因mRNA的3′ UTR通过碱基互补配对原则结合并抑制转录后翻译,进行基因表观遗传学修饰和调节相关蛋白表达及信号通路的转导,是基因转录后调节的关键因子。circRNA是一种闭环结构的ncRNA,其结构稳定且不易受RNA外切酶的影响,广泛存在于真核细胞的细胞质及外泌体中。circRNA最常见作用是与miRNA结合,抑制相关miRNA功能,从而有效调节相关蛋白的表达及功能。miRNA/circRNA广泛存在于外泌体中。由于细胞稳态不同、存在环境差别和细胞种类差异,miRNA/circRNA在外泌体中表达量及类型也千差万别[30-31]。多项研究表明,外泌体能有效保护miRNA/circRNA在细胞传递过程中的稳定性,miRNA/circRNA也能有效抑制NPC凋亡、促进细胞增殖、抑制炎性反应,从而促进ECM合成,缓解IDD。因此,外泌体凭借其包含的miRNA/circRNA,在治疗IDD上具有良好的临床应用前景。

Yuan等[32]研究发现,人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hucMSC)外泌体包裹的miR-26a-5p能够下调甲基化转移酶14(METT14)表达,降低NLRP3、IL-1β和IL-18表达水平,抑制细胞焦亡及炎性反应,从而缓解IDD进程。Xu等[33]研究发现,来源于富含血小板血浆的包裹miR-141-3p的外泌体与过氧化氢(H2O2)诱导的退变NPC共培养后,miR-141-3p能够与Kelch样ECH联合蛋白1(keap1) mRNA的3′ UTR结合,降低keap1的表达,引起核因子E2相关因子2(Nrf2)从keap1-Nrf2复合小体中释放并从细胞质向细胞核转位,从而发挥其抗氧化的生物学功能,最终抑制NPC凋亡;体内研究也表明,miR-141-3p可以通过keap1-Nrf2通路延缓IDD进展。Zhang等[34]的研究发现,自噬可以促进NPC来源外泌体的分泌,其包裹的miR-27a可靶向MMP-13,并抑制MMP-1、3、9、13以及ADAMTs 4、5基因的表达,最终增加蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白的表达,促进ECM稳定性。Xie等[35]分离包裹miR-31-5p的间充质干细胞源性外泌体,并将其与TBHP造模的退变NPC共培养。他们发现miR-31-5p显著降低内质网应激激活作用转录因子6(ATF6)的表达水平,同时,NPC凋亡相关蛋白和钙化相关蛋白显著下降,内质网应激标志性表达产物下调。包裹miR-31-5p的外泌体能通过ATF6/ER-Stress通路减轻髓核细胞凋亡及钙化,维持NPC活性,减缓IDD进展,从而对椎间盘组织起到保护作用。

3 外泌体与生物材料结合的新发展

目前,越来越多的研究表明,不同干细胞来源的外泌体能够显著延缓IDD进展。外泌体对于抑制NPC凋亡、代谢紊乱、ECM降解等作用亦日趋明确。通过干细胞来源的外泌体途径治疗IDD虽有效果,但无法避开干细胞外泌体被体内清除和破坏的弊端。干细胞来源外泌体无法在体内持久发挥作用是外泌体在临床治疗应用中遇到的一大阻碍,找到一种合适的方法促进外泌体的缓释并减少其降解,成为外泌体研究的热点方向。水凝胶(hydrogel)是一种亲水类聚合物,具有通过共价键和氢键作用交联形成的三维网络结构[36]。水凝胶具有良好的生物相容性、较大的比表面积以及良好的生物可控性,是药物和生物化学产物良好的载体,同时具有良好的生物支撑性[37]。水凝胶优良的特性,提示了其在临床治疗领域发挥作用的可能性。生物材料与外泌体的强强联合,为抑制NPC凋亡和ECM代谢紊乱,延缓IDD进展打开了新的思路。

Xing等[38]采用脂肪间充质干细胞(ADSC)制备表达外泌体标志蛋白ALIX、TSG101的外泌体,同时采用新型方法制备了一种具有良好热敏性、脱细胞成分的ECM水凝胶,这种新型水凝胶不含有毒的交联剂,其特性更类似于髓核组织。他们将富集得到的外泌体固定于ECM水凝胶上,形成富含脂肪间充质干细胞外泌体的热敏脱细胞ECM水凝胶(dECM@exo)。这种外泌体水凝胶在37℃时具有高粘度,同时其缓释曲线表明,在28 d里dECM@exo逐渐释放了大部分的外泌体,这表明其具有良好的缓释性和持续性。他们将dECM@exo与NPC共培养,并进行免疫荧光、细胞活力测试和荧光染色等实验,发现dECM@exo具有良好的生物相容性。而MMP13作为ECM降解的主要分解代谢酶之一,dECM@exo能有效抑制其表达,从而减少ECM降解。dECM@exo还降低了NLRP3、cleaved Caspase-1、NT-GSDMD和IL-1β的表达,并降低了细胞焦亡水平。在动物实验中,他们通过针刺进行大鼠尾巴退变造模,在培养0、4、8、16周后进行椎间盘高度和免疫组化等检测,发现dECM@exo能够有效地维持椎间盘高度、抑制蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白分解,从而显著延缓IDD进程。

4 总结与展望

目前的研究显示,外泌体具有良好的抗炎、抗细胞凋亡、抗细胞外基质降解、促进干细胞分化、促细胞增殖的作用。外泌体还能通过非编码RNA的细胞间递送,进行表观遗传修饰并调节蛋白质表达及细胞功能。在IDD的治疗中,外泌体能够通过多种途径抑制NPC凋亡并维持ECM合成和分解的稳定。虽然外泌体具有抑制IDD进展的作用,但其具体机制尚不完全明确。部分研究表明,外泌体具有“双刃剑”功能,既可延缓退变进程,也可能加重退变[12],主要取决于外泌体来源的细胞。同时,如何有效地筛选、制备、存储和运输外泌体,也是外泌体研究的一大难题。其次,如何保证外泌体在椎间盘高渗、低氧环境下保持活性并长期有效释放,从而持续发挥抵抗退变进展的作用,目前尚未得到答案。令人振奋的是,通过外泌体与生物技术有效结合,将外泌体与生物材料进行优势互补,提高了外泌体在临床实际应用的可能性。相信随着对外泌体作用机制的不断研究,外泌体在治疗椎间盘退变及其他医学领域的应用前景将更加光明。