通阳宽胸方治疗稳定型心绞痛的网络药理学机制研究

刘文甜， 梁文坚， 刘鹏， 陈丽芳， 徐槐敏， 李雪娇

（1.广州中医药大学，广东广州 510405；2.广东省第二中院，广东广州 510095）

稳定型心绞痛（stable angina pectoris，SAP）是冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）的一种亚型。冠心病有不同的转归，而其关键治疗时期在于稳定型心绞痛的防治。目前，SAP治疗主要包括三个方面：改变生活方式、药物治疗以及经皮冠状动脉介入术治疗。药物治疗和介入治疗确实极大地改善了冠心病患者的病情，但也存在一些临床问题，例如：硝酸酯类药物易导致头痛和低血压，他汀类药物可导致肝功能的损害以及支架手术后易发生再狭窄。而中医治疗SAP 具有一定优势，不但能改善临床症状，还能通过对病理损伤的修复，延缓病程的进展，从而起到防治的效果[1]。

SAP 归属于中医学“胸痹心痛”的范畴。岭南心血管病温通学派创始人、全国名老中医学术继承指导专家、广东省名中医王清海教授提出，冠心病病理基础具有多虚、多郁、多痰、多瘀四个特点，SAP的基本病机则在于胸阳不振，痰瘀内阻。基于SAP 的病机，王教授提出了通阳宣痹、活血化痰的治法，创制了治疗SAP 经验方——通阳宽胸方，并以院内制剂的形式多年来一直应用于临床中。前期多项临床研究[2-3]已证实，通阳宽胸方在治疗SAP 方面可提高患者的运动耐量，同时也可缓解SAP 的临床症状，减少心绞痛症状发作的次数和急性发作时所需硝酸甘油的使用量，能够减短发作时间，且不良反应少；前期的动物实验也已证实，该方不仅能显著改善MIR 的冠脉循环障碍，对缺血性心肌后再灌注的心肌收缩能产生稳定作用，而且也能阻止冠状动脉粥样硬化大鼠血栓重塑，并通过降低总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平而改善高脂状态，通过降低白细胞介素（IL）-17A、血管细胞黏附因子（VCAM）-1 和细胞间黏附分子（ICAM）-1的表达水平减少炎症，从而起到减小斑块体积，合理调节人体脂代谢，增强斑块的稳定性，以及防止动脉粥样硬化形成等作用[4]。但通阳宽胸方治疗SAP 的活性成分及具体作用机制仍不完全清楚。因此，本研究采用网络药理学研究方法探究通阳宽胸方治疗SAP 的机制，以期为通阳宽胸方的实验研究和临床应用提供更多参考，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 组方活性成分及靶点获取借助中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（https://tcmspw.com），以类药性≥0.18且口服生物利用度≥30%为条件，依次筛选通阳宽胸方中桂枝、薤白、瓜蒌皮、醋延胡索、川芎、醋香附、红花、陈皮、法半夏、枳实的活性成分，TCMSP 数据库中没有收录的药物，使用本草组鉴HERB数据库（http://herb.ac.cn/）筛选活性成分，删去无靶点的化合物，将得到的通阳宽胸方潜在的活性成分及靶点进行汇总。

1. 2 疾病靶点获取以“stable angina pectoris”“stable angina”“stable disease angina pectoris”为关键词，在GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）、TTD数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）、ETCM数据库（http://www.tcmip.cn/ETCM/）、DrugBank 数据库（https://go.drugbank.com/）、PhamGkb 数据库（https://www.pharmgkb.org/）中进行搜索。为避免GeneCards 基因数过多，以score ≥0.90 为条件筛选，获取SAP疾病靶点。

1.3 疾病与药物靶点交集及网络构建通过对通阳宽胸方靶点和SAP 疾病靶点进行Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org）的统一整合和删除，最终可获得具有相交集的基因名。通过Venn 图分析，确定药物和疾病的共同作用靶点。在此基础上，在数据库STRING（https://string-db.org/）中导入共同靶点， 参数设置为“Homo sapiens”“highest confidence=0.900”“hide disconnected nodes in the network”，通过整合和分析，构建药物-疾病靶点蛋白协同生效的蛋白互作（PPI）网络图，以了解靶点蛋白质之间的相互作用机制，深入探究蛋白质在系统中的作用机理。

1.4 富集分析通过R语言软件中的Bioconductor包进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析以解析药物疾病交集靶点基因，展示通阳宽胸方在治疗SAP中的潜在生物学过程和途径，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 通阳宽胸方潜在活性成分及相关靶点结果获得通阳宽胸方中桂枝5 个、薤白9 个、瓜蒌皮9 个、醋延胡索28 个、川芎8 个、醋香附17 个、红花18个、陈皮4个、法半夏12个、枳实18个有效成分，共有128个有效成分，去除重复后有108个有效成分。共获得2 539 个靶点，去除重复后有915个。如表1所示。

表1 通阳宽胸方包含的化合物及对应潜在靶标个数Table 1 Compounds contained in Tongyang Kuanxiong Prescription and the number of corresponding potential targets

2.2 SAP疾病靶点和药物-疾病共同靶点如图1所示，在ETCM数据库中得到29个靶点，DrugBank数据库中得到80 个靶点，TTD 数据库中得到42 个靶点，PhamGkb数据库中得到6个靶点，GeneCards数据库中得到2 598 个靶点，共得到2 755 个疾病靶点，去除重复值后共有2 648个。与通阳宽胸方108个成分对应的915个药物靶点和SAP的2 648个疾病靶点进行Venn 分析，最终可得出548 个共同靶点。

图1 稳定型心绞痛（SAP）相关靶点合集（A）与通阳宽胸方和SAP疾病基因交集Venn图（B）Figure 1 SAP-associated target ensemble（A）and Venn diagram of the intersection of Tongyang Kuanxiong Prescription and SAP disease genes（B）

2.3 药物-有效成分-靶点网络模型分析结果将通阳宽胸方治疗SAP 的548 个靶点导入Cytoscape 3.7.2 软件进行可视化，构建通阳宽胸方与SAP 的药物-有效成分-靶点网络，结果如图2所示，网络图共包括666 个接点，4 221 条相互作用关系。其中粉色方形节点代表SAP 和通阳宽胸方共有的靶点，三角形表示通阳宽胸方中的中药，蓝色圆形表示中药有效成分，饼图为中药的共同有效成分。

图2 通阳宽胸方治疗稳定型心绞痛（SAP）的药物-有效成分-靶点网络图Figure 2 Diagram of the drugs-active ingredientstarget networks of Tongyang Kuanxiong Prescription for treatment of SAP

2.4 通阳宽胸方治疗SAP 的PPI 网络将通阳宽胸方干预SAP 的549 个靶点导入STRING 数据库，利用Cytoscape 3.8.2 软件进行可视化分析，构建PPI网络。见图3。其中颜色越深表示其度（degree）值越大，相关性越高。根据degree 值排序，选择前30 个靶点作为关键靶点，即SRC、TP53、PIK3R1、 AKT1、 STAT3、 HSP90AA1、 MAPK3、MAPK1、 PIK3CA、 CTNNB1、 GRB2、 HRAS、JUN、 RELA、PTPN11、 EGFR、 LCK、 MAPK14、MAPK8、FYN、RAC1、ESR1、RXRA、HDAC1、JAK2、LYN、JAK1、PTK2、STAT1、VEGFA。上述靶点的节点degree 值均大于56，提示这些靶点在通阳宽胸方治疗SAP 的网络中可能发挥重要作用。

图3 通阳宽胸方治疗稳定性心绞痛（SAP）的蛋白-蛋白互作（PPI）网络图Figure 3 Protein-protein interactions network diagram of Tongyang Kuanxiong Prescription for treatment of SAP

2.5 富集分析结果及可视化从STRING 中获取GO条目4 357条，生物学过程（BP）3 772条，细胞组成（CC）203条，分子功能（MF）382条。其中：主要涉及的生物学过程（BP）包括应激反应、细胞增殖、细胞对化学刺激的反应等；细胞组成（CC）主要与囊泡、细胞外间隙、细胞器等相关；分子功能（MF）方面主要与蛋白结合、酶结合、蛋白质催化等功能关联。以上分析均根据显著性选取排前20位的条目作图，具体见图4。对于潜在的靶点蛋白KEGG通路富集分析，可得到KEGG富集信号通路199 条，根据其显著性选取排前30 位的通路作图，结果如图5所示。与SAP相关的通路主要涉及PI3K-AKT 信号通路、cAMP 信号通路、脂质和动脉粥样硬化、细胞凋亡、细胞衰老、HIF-1信号通路等。

图4 GO分析Figure 4 GO enrichment analysis

图5 KEGG分析Figure 5 KEGG enrichment analysis

3 讨论

本研究借助网络药理学探索了通阳宽胸方治疗稳定型心绞痛（SAP）的潜在作用机制。利用TCMSP 进行筛选，确定了与通阳宽胸方相对应的靶点，共有108种主要的活性成分构成了该方的有效成分，其中，β-谷甾醇、川芎咔啉碱、川陈皮素、柚皮素、槲皮素、橙皮素、山柰酚等可能起主要治疗作用。研究表明，川芎咔啉碱可显著地增强冠脉血流量和心脏供给血流量，促进血管内皮细胞（VECs）损伤时的恢复，维护血管壁的光滑、完整性，防止血栓的产生[5]。橙皮素的相关研究结果表明，其能有效调节血脂，对血管内皮细胞具有促生长及增殖迁移作用，可以有效调节一氧化氮（NO）、内皮素1（ET-1）等多种血管活性物质，在血管病理或生理生成中起着重要作用[6]，是反映血管内皮功能的重要细胞因子。相关动物实验研究[7]表明，β-谷甾醇可以抑制心肌缺血再灌注损伤大鼠的氧化应激反应和炎症反应，通过调节相关通路减少细胞凋亡从而减轻心肌损伤。川陈皮素是一种天然的多甲氧基黄酮，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的功效，通过调控PI3K-AKT信号通路，可减轻内质网应激相关的细胞凋亡，从而减轻心肌缺血再灌注损伤[8]；山柰酚可抑制环氧合酶、淋巴因子白细胞介素6（IL-6）、IL-1、IL-18和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的释放，起到抗炎的保护作用[9]。柚皮素可减少血管壁中脂肪条纹的形成和巨噬细胞浸润，抑制平滑肌细胞的增殖和迁移，纠正血脂异常相关的代谢紊乱，发挥抗AS 的作用[10]。研究[11]显示，脂多糖（LPS）诱导了血管平滑肌细胞中活性氧簇（ROS）生成导致的动脉粥样硬化，而槲皮素可以激活PI3K-AKT调节的Caspase-3和NF-κB，减少ROS 生成，改善动脉粥样硬化。β-谷甾醇、川陈皮素、山柰酚、柚皮素及槲皮素均有明显的抗炎作用，通过抑制炎症的产生和氧化应激，减少内皮损伤，改善动脉粥样硬化，阻止SAP 的发生发展。上述药物活性成分的生物学功效均与SAP 机制相关，因此，推断这些有效物质联合作用于SAP，从而发挥治疗效果。

通阳宽胸方的有效成分靶点和SAP靶点的PPI排前30 位靶点的功能分析显示，该方可通过对损伤血管内皮的保护、抑制炎症的产生和氧化应激等方面发挥对冠心病的治疗作用。其中，SRC、TP53、 HSP90AA1、 STAT3、 MAPK3、 AKT1、VEGFA等7个靶点在该方预防SAP发病和治疗SAP中发挥着关键的作用。研究结果表明：SRC家族蛋白酪氨酸激酶与主要心脏生理活动和疾病调控过程中的重要信息传导有关，同时，其功能还与对主要心血管稳态的长期监护作用有关。在各种损伤因素和应激因子的共同作用下，SRC磷酸化水平也发生了改变，从而能够通过调节其增殖、分化、运动形态和机能以及电生理学变化而达到预防各类慢性心脏病变的作用，包括高血压、糖尿病、缺血性心脏病、心肌缺血和灌注损害、严重心律失常和心肌病等[12]。AKT1 主要参与细胞的增殖、新陈代谢、细胞生长、抗细胞凋亡及血管的生成等诸多细胞过程的调节[13]。TP53 在细胞衰亡的调控中及动脉粥样硬化的发生发展过程中也起着关键作用，通过对细胞增生繁殖和衰亡过程的调控，促使内皮细胞和平滑肌细胞在动脉壁内的再分布。另外，当血管内壁受到各种损伤因素的刺激时，TP53 可启用损伤信号通路，对损伤的内壁细胞进行修复[14]。HSP90AA1是一种应激诱导蛋白，能够调节蛋白激酶，并维持细胞稳态。研究发现，HSP90AA1能够减轻心肌细胞的缺血再灌注损伤[15]，同时能够与心脏成纤维细胞中转化生长因子β（TGF-β）结合，抑制心肌细胞的纤维化[16]。STAT3、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）3均在炎症反应中发挥着重要作用。MAPK3 是MAPK 信号通路的重要成员，参与内皮细胞的活性和炎症[17]。STAT3激活可以促进血管生成、保护内皮细胞、抑制心肌细胞凋亡，改善心肌梗死后心肌重塑[18]。VEGFA 是一种具有促进内皮细胞增殖作用的细胞因子，其与VEGF受体在胞外结合，可促进内皮细胞增殖，增加血管通透性，是血管生成的关键介质，诱导内皮细胞增殖，促进细胞迁移，抑制细胞凋亡并诱导血管通透[19]。

KEGG 通路富集分析发现，6 条主要通路与通阳宽胸方治疗SAP相关，包括：PI3K-AKT信号通路、cAMP信号通路、脂质和动脉粥样硬化、细胞凋亡、细胞衰老、流体剪切应力。PI3K-AKT信号通路在细胞增殖调控中扮演着至关重要的角色，PI3K-AKT可以减少糖原的合成并增加糖酵解，通过N-磷酸化抑制糖原合酶激酶3β活性增加细胞周期蛋白D1 的积累，从而通过PI3K-AKT 信号通路促进细胞周期并改善细胞增殖，促进细胞生长并抑制凋亡[20]。PI3K-AKT 信号通路还通过多种途径影响心脏组织中各种细胞因子的产生及表达，调节血管内皮细胞因子的表达，减少血管内皮损伤，从而影响动脉粥样硬化的发生和发展。此外，PI3K-AKT信号通路可以调节巨噬细胞的极化和存活以及炎症因子的表达和血小板功能，影响动脉粥样硬化的进展[21]。cAMP 是一种重要的生物分子，不仅可以激活心肌细胞，还能有效提高已经被激活的心肌细胞的抗损伤能力，进一步增强其对于损伤和缺血缺氧等的抵御能力[22]。动脉粥样硬化与动脉血管内膜的脂质沉积及血管炎性反应机制关系密切，而动脉粥样硬化和斑块形成均可导致动脉管径狭窄甚至闭塞，是SAP 的重要病理基础[23]。流体剪切应力指血流对血管壁产生的摩擦力，低流体剪切应力诱导内皮细胞在血流方向的排列失败，加速炎症细胞浸润，促进活性氧的释放及动脉粥样硬化斑块的扩大[24]。血管内皮细胞是血管壁的屏障，在各种病理因素（炎症因子、氧化应激、放/化疗、血流剪切力等）刺激下，血管内皮细胞衰老，内皮损伤和功能障碍，是导致各种急性血管事件的重要病因[25]。细胞凋亡是细胞的死亡形式之一，血管内皮细胞凋亡导致内皮细胞的完整性破坏，脂质沉积，是动脉粥样硬化发生发展的关键因素[26]。袁丁等[27-28]以通阳化浊法干预冠状动脉粥样硬化大鼠，结果显示，通阳化浊法可降低大鼠TC、TG、LDL-C水平以改善血脂状况，降低IL-17A、VCAM-1 和ICAM-1 的表达以减轻炎症，减少MMP2、MMP9 表达以增加斑块稳定性，从缩小斑块面积与增加斑块稳定性的角度，基于调脂、抑炎、稳斑，进一步阐释了通阳宽胸方治疗SAP的作用机理。

综上所述，通阳宽胸方可能通过SRC、TP53、HSP90AA1、STAT3、MAPK3、AKT1、VEGFA 等靶点，调节PI3K-AKT 信号通道、cAMP 信息通道、细胞凋亡、细胞衰老、流体中的剪切应力调节和动脉粥样硬化等信号通路，起到防治SAP 的效果。通过网络药理学分析，可以从整体观探讨中药多成分、多靶点的药理作用，对中医药机理分析提出了全新的科研思想与方法。本研究成果反映了中药复方多组分、多靶点、多途径的药效特性，为通阳宽胸方治疗SAP 提出新思路，但目前网络药理学仍然具有不足之处，本实验结论除了现有资料基础之外，部分结论还需借助有关实验进行研究验证。