枸杞多糖对心肌梗死大鼠心肌肌钙蛋白I表达及心脏微血管的影响

李会贤， 张爱爱， 张亚维， 陈伟广， 马骁

（1.河北北方学院附属第一医院心血管内科，河北张家口 075000；2.张家口市卫生健康委员会，河北张家口 075000；3.河北北方学院附属第一医院住院处，河北张家口 075000）

心肌梗死（myocardial infarction）是临床常见的心血管疾病，是慢性心力衰竭的主要原因，最新调查数据显示，其已经成为全球非传染性疾病患者死亡的首位原因[1]。目前，临床治疗心肌梗死的方法主要为溶栓、冠脉搭桥术或西药等西医治疗方式，但治疗效果并不理想，因此探寻一种有效的治疗方法是临床亟待解决的问题[2]。从中草药中寻找心脏保护的有效药物一直备受关注。枸杞多糖是常见中药枸杞子（为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果实）的主要药用成分，在降脂降糖、降血压、抗氧化、提高免疫力、抗细胞凋亡等方面发挥重要作用，且已被证实具有保护心脏的作用[3-4]，但其作用机制尚不完全明确。

心肌梗死为急性心肌缺血坏死，心脏微血管损伤是导致其发生、发展的关键因素之一。研究发现，心脏微血管损伤会导致心肌细胞供给不足，进而造成局部急性血栓形成，从而引起心肌梗死[5-6]。改善心脏微血管功能，保护其不受损伤成为治疗心肌梗死的有效切入点。另外，心肌肌钙蛋白I（cTnI）是心肌收缩的重要装置之一。近年来研究[7]发现，cTnI在心肌受损后血清浓度显著升高，且持续时间长，为反映心肌损伤及心肌细胞坏死的重要标志物，特异度及敏感性均较高，被广泛用于临床研究监测。因此，本研究构建心肌梗死大鼠模型，观察枸杞多糖对心肌梗死大鼠cTnI 表达及心脏微血管的影响，探讨枸杞多糖的心脏保护作用，以期为其临床治疗提供科学依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物50只SPF级雄性SD大鼠，平均体质量230 ~ 290 g，购自江苏华创信诺医药科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK（苏）2018-0001，动物使用许可证号：SYXK（苏）2018-0034。实验动物方案已获得河北北方学院附属第一医院伦理协会的批准（批准号：201703-22）。按照《实验动物管理条例》规定进行实验。适应性喂养2周。

1. 2 药物、试剂与仪器枸杞多糖（分子式：C11H22O11，分子量：286.31，纯度：99.8%，北京康瑞纳有限公司生产，批号：A2721）；氯沙坦钾片（上海晅科有限公司，批号：XKB3693）。苏木素染液（北京百奥莱博有限公司）；伊红染液（北京博沃尔斯有限公司）；cTnI、一氧化氮（NO）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（上海臻科有限公司）；兔抗cTnI 抗体（深圳市安提有限公司）；兔抗内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗体（武汉益普有限公司）；兔抗血小板内皮细胞黏附因子1（PECAM-1）抗体（深圳豪地华拓有限公司）；兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（深圳豪地华拓有限公司）。MyLab 型大小鼠便携式彩色多普勒超声成像仪（上海玉研有限公司）；CX-60 型光学显微镜（日本Olympus 公司）；HSA-M1812 型酶标仪（深圳海思安有限公司）。

1. 3 心肌梗死模型构建[2]随机选取40 只大鼠，固定后，腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg 麻醉，常规备皮、消毒后，连接好呼吸机、监护仪，然后充分暴露心脏，剪开心包膜，找到左冠状动脉前支并结扎。术毕闭合胸腔，逐层缝合后，皮下注射8 U/kg青霉素，心电图继续监测6 h，若ST段上抬到弓背向上，则视为建模成功。建模过程中3只大鼠死亡，其余37只均建模成功。

1.4 分组与给药选取建模成功的30只大鼠随机分为模型组、氯沙坦组、枸杞多糖组，每组10 只，取剩余10只健康大鼠作为正常组。建模成功后2 h，氯沙坦组灌胃20 mg/kg 氯沙坦生理盐水混悬液[4]，对枸杞多糖组灌胃120 mg/kg 的枸杞多糖生理盐水混悬液[8]，每日1 次，治疗28 d。正常组、模型组同期灌胃同体积生理盐水。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 心肌功能监测 采用心脏彩超检查大鼠心功能，包括左室收缩末期内径（LVSD）、左室舒张末期内径（LVDD）、室间隔（IVS）、左心室劳损（LVS）、左室射血分数（LVEF），各项数值均经计算机处理后获得。

1.5.2 心脏微血管密度检测 心肌功能监测完成后，腹腔注射3%戊巴比妥钠40 mg/kg 麻醉处死大鼠，然后由颈静脉将凝胶墨汁染色液注入心脏检测微血管密度。

1. 5. 3 HE 染色法观察心肌组织病理学形态 取各组大鼠心肌组织，制备石蜡切片，常规脱蜡复水后，苏木素染色5 min。蒸馏水洗涤后，1%盐酸酒精分化30 s，0.2%氨水中返蓝2 min，蒸馏水洗涤，伊红染色10 min。去除多余染液，进行脱水、二甲苯透明和中性树胶封片处理，光学显微镜下观察组织病理学。

1.5.4 ELISA法检测血清cTnI、NO含量 取各组大鼠血清，严格按照ELISA 试剂盒说明书操作，应用酶标仪于405 nm 波长处检测吸光度，并绘制标准曲线，根据标准曲线计算cTnI、NO含量。

1. 5. 5 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测心肌组织cTnI、eNOS、PECAM-1蛋白表达 取各组大鼠心肌组织，加入400 μL RIPA 和4 μL 蛋白酶抑制剂，匀浆机匀浆后，冰盒上裂解40 min，离心并取上清液。二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度，取100 μg 等量蛋白，经十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）后，半干法将蛋白转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%牛血清白蛋白（BSA）封闭2 h。洗膜，加入稀释的cTnI、eNOS、PECAM-1（1∶1 000）一抗，4 ℃摇床孵育过夜。洗膜，加入稀释的二抗（1∶5 000），室温轻摇孵育30 min。化学发光显影、定影、拍照。用Image-Pro Plus 6.0软件分析条带灰度值，计算与GAPDH 的比值求得cTnI、eNOS、PECAM-1蛋白相对表达量。

1.6 统计方法采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌功能相关指标比较表1 结果显示：与正常组比较，模型组LVSD、LVDD、IVS、LVS 均显著升高（P＜0.05），LVEF 显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，枸杞多糖组、氯沙坦组大鼠LVSD、LVDD、IVS、LVS 均显著降低（P＜0.05），LVEF 显著升高（P＜0.05），且枸杞多糖组的改善效果优于氯沙坦组（P＜0.05）。

表1 各组大鼠心肌功能相关指标比较Table 1 Comparison of myocardial function-related indexes among each group of rats（±s）

表1 各组大鼠心肌功能相关指标比较Table 1 Comparison of myocardial function-related indexes among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与氯沙坦组比较

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2.2 各组大鼠心肌组织病理形态比较图1 结果显示：正常组心肌组织结构正常，心肌细胞排列清晰整齐，未见明显炎症细胞浸润；模型组心肌组织结构遭到破坏，心肌细胞出现大量坏死，心肌纤维断裂，可见大量炎症细胞浸润；与模型组比较，枸杞多糖组、氯沙坦组病理结构明显改善，胞浆横纹清晰，炎症细胞明显减少。

图1 各组大鼠心肌组织病理形态比较（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of histopathological morphology of myocardium among each group of rats（HE staining，×200）

2.3 各组大鼠血清cTnI、NO含量比较表2结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血清NO含量显著降低（P＜0.05），cTnI 含量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，枸杞多糖组、氯沙坦组血清NO含量显著升高（P＜0.05），cTnI 含量显著降低（P＜0.05），且枸杞多糖组的改善效果优于氯沙坦组（P＜0.05）。

表2 各组大鼠血清cTnI、NO含量比较Table 2 Comparison of serum cTnI and NO levels among each group of rats（±s）

表2 各组大鼠血清cTnI、NO含量比较Table 2 Comparison of serum cTnI and NO levels among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与氯沙坦组比较

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2.4 各组大鼠心脏微血管密度比较正常组、模型组、氯沙坦组、枸杞多糖组心脏微血管密度分别为（289.54 ± 16.44）（110.65 ± 5.33）（195.92 ±9.07）（226.36±12.51）（F=32.730，P＜0.001）。与正常组比较，模型组大鼠心脏微血管密度显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，枸杞多糖组、氯沙坦组心脏微血管密度显著升高（P＜0.05），且枸杞多糖组的改善效果优于氯沙坦组（P＜0.05）。心脏微血管分布见图2。

图2 各组大鼠微血管分布比较（×200）Figure 2 Comparison of microvessel distribution among each group of rats（×200）

2. 5 各组大鼠心肌组织cTnI、eNOS、PECAM-1蛋白表达比较表3、图3 结果显示：与正常组比较，模型组心肌组织cTnI 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），eNOS、PECAM-1 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，枸杞多糖组、氯沙坦组心肌组织cTnI 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），eNOS、PECAM-1 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），且枸杞多糖组的改善效果优于氯沙坦组（P＜0.05）。

图3 各组大鼠心肌组织cTnI、eNOS、PECAM-1的Western Blot条带Figure 3 Western Blot bands of cTnI，eNOS and PECAM-1 in rat myocardial tissue in each group of rats

表3 各组大鼠心肌组织cTnI、eNOS、PECAM-1蛋白相对表达量比较Table 3 Comparison of protein relative expressions of cTnI，eNOS，and PECAM-1 in myocardial tissues among each group of rats（±s）

表3 各组大鼠心肌组织cTnI、eNOS、PECAM-1蛋白相对表达量比较Table 3 Comparison of protein relative expressions of cTnI，eNOS，and PECAM-1 in myocardial tissues among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与氯沙坦组比较

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3 讨论

近年来，随着人们生活方式及节奏的日益改变，心肌梗死的患病率呈急剧上升态势，据调查显示，我国每年新增心肌梗死人数高达60万[9]。探求心肌梗死发病的始动因素，防治其发生、发展对提高患者生活质量及生存具有积极而深远的意义[10]。

既往研究发现，枸杞多糖可通过拮抗心肌细胞凋亡、维持线粒体平衡、抗氧化等作用，修复心肌细胞损伤，改善心肌功能，有效治疗大鼠心肌缺血再灌注（I/R）、心肌梗死[4，11-12]。本研究结果亦显示，枸杞多糖可显著改善心肌梗死大鼠心肌功能及心肌组织病理形态，进一步证明其对心肌梗死具有显著疗效。氯沙坦是第一个血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物，其可通过抑制缺血再灌注后心肌细胞凋亡，对心肌梗死起到治疗作用，是临床治疗心肌梗死的常用药物，因此，本研究选其作为阳性对照药物[5，13]。本研究结果表明，枸杞多糖对心肌梗死大鼠心功能的改善效果优于氯沙坦。

cTnI 是仅存在心肌内的一种蛋白，定位于肌小节细肌丝上，可参与心肌收缩和舒张的调节，其在正常人中表达很少，但受到如炎症等病理性刺激其水平就会升高[14]。研究[15]发现，在心肌梗死早期cTnI 就会释放入血，且表达不会受到血液其他因素的影响，同时cTnI 表达异常可能与心肌梗死后心衰密切相关。本研究结果显示，枸杞多糖可显著降低心肌梗死大鼠血清cTnI 含量，降低心肌组织cTnI 蛋白表达，表明枸杞多糖可能是通过抑制cTnI 转录及翻译，抑制cTnI 释放入血，进而有效改善心肌舒缩功能，改善心肌损伤，最终有效延缓疾病进展。

心脏微血管在控制组织循环流量、收缩功能、组织代谢、节律控制方面发挥重要作用，其功能正常是心脏微循环正常的前提，心脏微循环损伤是造成心肌梗死发生、发展的潜在因素之一[16]。有研究[17]表明，心肌梗死后心脏微血管密度显著降低，是引起心肌缺血、缺氧、代谢效率降低的主要原因，同时与NO、eNOS一样也是反映心脏微血管损伤的关键指标。而PECAM-1作为免疫球蛋白超家族的重要成员，其在血管生成、信号传导等血管生物学方面具有不可或缺的作用，检测其表达可有效判断心脏微血管数量、功能状态以及与疾病的关系[18]。本研究结果显示，枸杞多糖可显著抑制升高心肌梗死大鼠微血管密度，促进NO、eNOS、PECAM-1 表达，这说明枸杞多糖可显著改善心脏微血管损伤，对心脏微血管具有一定保护作用，其可能是通过促进心脏微血管生成，进而改善心肌缺血、缺氧状态，抑制细胞凋亡，最终达到保护心脏微血管，改善疾病症状的目的。

综上所述，枸杞多糖可显著降低心肌梗死大鼠心肌cTnI 水平，改善心脏微血管损伤，对心脏具有一定的保护作用，且优于氯沙坦。