铅胁迫下东南景天耐铅内生细菌种群多样性分析

李佳益,李曦,范铭丰,王晓艳,刘希华

(1.福建省资源环境监测与可持续经营利用重点实验室,福建 三明 365004;2.三明学院 资源与化工学院,福建 三明 365004;3.三明市土肥站,福建 三明 365000; 4.三明市林业局,福建 三明 365000)

土壤重金属污染是一个世界性的紧迫问题。土壤中金属含量的持续增加通过食物链对人类和动物的健康构成威胁。土壤中的重金属会抑制大多数植物的生长,尤其是非必需的重金属,如Pb、Cd、Cr等[1]。植物细胞具有一系列潜在的重金属的解毒机制,从而有重金属胁迫的耐性[2]。内生细菌不仅具有抵御重金属毒性的能力,还能增加宿主植物对养分的获取,增强其对抗胁迫的代谢活性[3]。因此,利用内生细菌缓解重金属对寄主植物的毒性是提高植物重金属耐受性的有效策略。

东南景天(Sedumalfredii)属景天科(Crassulaceae),是一种Cd/Zn超富集植物和Pb高富集植物,21世纪初在中国被发现。东南景天的营养繁殖简单和快速生长的特性以及显著的Cd、Zn和Pb吸收、积累特性使其成为植物修复多重污染土壤的最佳种质资源[4]。但由于其植株矮小,生物量较小,修复重金属污染土壤的效果甚微。林木生物量大,生长快速,作为能源植物获得经济收益,是理想的植物修复材料,但由于重金属对多数林木有毒害作用,导致幼树生长下降,严重可致其死亡[2]。研究发现,一些植物生长促进菌(plant growthpromoting bacteria,PGPB)可以通过刺激植物激素(生长素、细胞分裂素、赤霉素等)的合成来辅助寄主植物,通过产生铁团、增磷和固氮来缓解营养缺乏,通过细胞外沉淀、细胞内积累、隔离和酶解毒(如氧化/还原)降低重金属生物毒性[5]。此外,PGPB接种提高了成年植物的重金属积累和转运能力[6]。

本文分析铅胁迫东南景天耐铅内生细菌的种群多样性,分析其内生细菌的优势种群,将优势种群转接到林木种子或者幼苗上,以利于林木在幼苗期获得耐铅污染的能力,从而提升植物修复铅污染土壤的效率。

1 材料与方法

1.1 植物材料

1.1.1 植物材料 选择生长一致的东南景天植株移植到花盆中,砂子和壤土配比为1∶1。配制2.4、4.8、7.2、9.6、12 mmol/L硝酸铅溶液1000 mL,每3天浇灌一次东南景天,一次100 mL,30 d以后,土壤中铅离子的浓度达到相应处理浓度。铅胁迫处理之后更换成无菌水100 mL,一个月后采集长势好、无病害的东南景天的不同部位(根、茎、叶)新鲜组织进行内生细菌的分离。

1.1.2 培养基 配制2.4、4.8、7.2、9.6、12、14.4 mmol/L硝酸铅浓度的LB固体培养基。

1.2 方法

1.2.1 耐铅内生细菌分离 分别取东南景天根、茎、叶,清洗干净后,小量流水清洗1 h,分别移入组培瓶中。在超净工作台上完成如下工作:75%的酒精振荡清洗(根5 min,茎和叶各2 min),无菌水中振荡清洗5遍,最后一遍无菌水涂布LB培养基以确定是否为内生细菌。消毒后的材料分别在灭菌后的研砵添加3～5 mL无菌PBS缓冲液和石英砂进行研磨,吸取研磨后的汁液放入离心管中,在离心机中2000 r/min下离心3 min,吸取150 uL的上清液,涂布在含不同铅离子的培养基,3次重复,培养箱中30℃培养24 h,统计各培养皿的菌落数。

1.2.2 内生细菌基因组DNA提取和16S rDNA序列扩增 菌株基因组DNA用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(天根,DP302-02)进行提取,以通用引物8f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)(上海华大基因)进行PCR扩增。退火温度为52℃。PCR产物为1600 bp左右。

1.2.3 16S rDNA序列酶切图谱分析 选用HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ和TaqⅠ等4 种限制性内切酶消化16S rDNA扩增产物,经2%琼脂糖凝胶电泳检测,分析酶切结果,分别用0,1数字代表酶切条带的有无。

1.2.4 代表种群分子鉴定 筛选出聚类分析结果中的9个组群的代表种,扩增出16S rDNA片段,回收1600 bp左右的PCR产物并连接到pMD19-T Vector,挑取阳性克隆送往上海华大基因公司测序。序列经BLAST进行最大相似性比对,用Clustal X 1.83进行同源性分析[7]。

1.3 统计分析

采用DPS[8]进行方差分析。

应用Pritchard等[9]聚类分析方法(软件Structure Version 2.2)对供试的内生细菌的酶切结果进行群体遗传结构分析。其中设定群体数目(K)为2～15,Structure参数Burnin Period和afterBurnin均设定为10 000次,然后依据似然值最大的原则选取合适的K值[11],并画出基于模型的群体遗传结构图。

2 结果与分析

2.1 东南景天内生细菌分离情况

通过分离结果(图1、图2和图3)来看,从东南景天的根部分离出来的内生细菌的数量明显多于茎部和叶部,叶部所分离的内生细菌数量最少。以土壤中铅离子浓度为12 mmol/L的东南景天体内所分离出来内生细菌数量最多,而2.4 mmol/L组则数量最少。随着铅胁迫的浓度的增大,东南景天体内所共生的内生细菌数量也随之增加,以帮助东南景天来抵抗铅离子胁迫,而在低浓度的铅离子环境中,由于东南景天自身具有富集铅离子的特性,所以无需共生细菌来抵抗铅胁迫。不同铅离子浓度的培养基中分离内生细菌的数量也不同,趋势为随着培养基铅离子增加,相应的内生细菌的数量也随之增加,但培养基中铅离子的浓度超过9.6 mmol/L时,内生细菌数量开始下降,当培养基中铅离子浓度为14.4mmol/L时,内生细菌数量最少。方差分析结果表明(表1),东南景天不同部位、不同铅离子浓度土壤和不同铅离子浓度的培养基所分离的内生细菌的数量达到极显著差异。

注:图示为土壤中铅离子浓度,单位为mmol/L,下同。

图2 不同铅离子浓度土壤东南景天茎中不同铅浓度培养内生细菌的数量

图3 不同铅离子浓度土壤东南景天叶中不同铅浓度培养内生细菌的数量

表1 东南景天内生细菌方差分析表

2.2 东南景天内生细菌聚类分析

本文选取土壤和培养基铅离子浓度均为12 mmol/L的组合来分析东南景天体内生细菌的种群结构。选取根82株、茎29 株、叶7 株进行提取单菌落细菌DNA,扩增16S rDNA序列,经酶切,酶切产物有多种类型(图3)。整理四种酶的酶切图,分别用0,1数字代表酶切条带的有无,并进行统计。

图3 酶切凝胶电泳图

利用Structure软件对118株内生细菌菌株进行群体遗传结构分析,在K=2～12中,K=9时似然值最大(图4),因此东南景天内生细菌种群应分为9大类(图5),表明东南景天内生细菌种群具有明显的多元特性和异质性。

以第8组群数量最多,为24个,第9组群和第1组群数量也较多,分别是17个和15个,第6组群数量为13个,第3组群数量为11个,其他4个组群数就比较少,第5组群、第7组群、第2组群和第4组群分别为9个、9个、6个和6个,无法定义分类的种群数量为8个。说明第8和第9组群为主要组群。

选取这9个组群的代表菌株进行测序,将测序序列信息在NCBI数据库进行BLAST检索,分别找到与之相似性最高的种属,系统发育树构建,推断出这9个组群所代表的菌种如表2。从表2中可以看到,芽孢杆菌属(Bacillus)的数量在内生细菌中是最多的,假单胞菌属(Pseudomonas)和肠杆菌属(Enterobacter)的数量也占据优势。阪崎肠杆菌属(Cronobacter)和赖氨酸杆菌属(Lysinibacillus)的数量则是最少的。

表2 9个组群的代表菌种

3 小结与讨论

本文探讨了不同铅离子胁迫下的东南景天体内耐铅内生细菌的种群多样性。在预试验中,由于高浓度(土壤中铅离子浓度为14.4 mmol/L)的铅胁迫导致东南景天出现叶片发黄,且部分植株死亡,所以没有开展该处理的东南景天内生细菌的分离。通过分离实验,从东南景天的根部分离出来的内生细菌的数量明显多于茎部和叶部,叶部所分离的内生细菌数量最少。在铅胁迫培养东南景天内生细菌分离实验中,随着硝酸铅浓度的增加,内生细菌的数量也增加,以土壤中铅离子浓度12 mmol/L的东南景天体内所分离出来的内生细菌数量最多。不同铅离子浓度的培养基中分离内生细菌的数量也不同,9.6 mmol/L铅离子培养基中分离到内生细菌数量最多,而14.4 mmol/L铅离子的培养基中所分离到的内生细菌数量最少。利用Structure软件并结合分子鉴定对浇铅浓度和培养基铅离子浓度均为12 mmol/L所分离到118株东南景天内生细菌菌株进行群体遗传结构分析,表明芽孢杆菌属的数量在内生细菌中是最多的,依次是假单胞菌属和肠杆菌属,说明这三者是东南景天体内的优势种群。

随着全球工业化的发展,世界范围内土壤中的重金属浓度进一步增加,从而影响到人类的健康。因此如何修复土壤中的重金属污染是科学家亟待解决的问题。微生物与植物的联合修复既解决了微生物修复重金属污染的残留问题,也解决铅胁迫植物生长不良的问题,已成为现在研究热点。微生物在植物生长和发育中发挥着重要作用[10]。同时,植物微生物共生有效地改善了土壤质量和养分循环,因此,接种精选和驯化的微生物可以显著提高植物修复效率[11]。植物的种类和基因型、植物组织与植物内生细菌的种群密度关联性很大,有文献报道,植物超积累重金属的机制很可能与定殖于其组织内的内生菌多样性有着十分密切的关系[12],从部位来说植物根组织中的内生细菌的种群密度是最高的[13]。本文中,东南景天的根部的内生细菌数量也是远高于茎和叶组织。研究发现,一些植物生长促进细菌可以通过刺激生长素、细胞分裂素和赤霉素等植物激素的合成来帮助寄主植物;通过铁载体的产生、磷的溶解和固氮来缓解营养缺乏;通过细胞外沉淀、细胞内积累、隔离和酶解毒(如氧化/还原)来降低重金属的生物毒性[14-16]。随着铅胁迫浓度的增大,植物体内需要有更多内生细菌的数量,以促进植物的生长以及提高植物对铅的抗性。芽孢杆菌USTB-O 可提高小麦对 Cu 的积累,且能分泌 IAA促进植物生长[17];而假单胞菌能够向植物根际提供生长激素[18],促进植物生长的同时会产生抗氧化物质[19],吸收植物所产生的ACC以降低植物的乙烯含量[20];肠杆菌通过改变重金属价态的形式实现去除重金属毒性的作用[21]。这3类菌能够保护植物在铅胁迫逆境中的生长,成为东南景天内生细菌的优势种群。

东南景天体内具有丰富促生特性的内生细菌种质资源,这对于植物-微生物联合修复重金属污染菌群资源的开发及微生物肥料的菌种选育和生产应用具有重要意义。