纳米氧化镍暴露下人工湿地运行性能及微生物群落的响应

李璇，钱秀雯，黄娟*，王鸣宇，肖君

1. 江苏省环境工程技术有限公司，江苏 南京 210019；2. 东南大学土木工程学院，江苏 南京 210096

颗粒尺寸为1—100 nm 的材料通常被定义为纳米颗粒（Nanoparticle，NPs）（Klaine et al.，2008），其中纳米氧化镍（NiO NPs）是一种具有特殊的光学和电化学性质的“过渡性纳米粒子”，在食品包装、医疗药品、电子技术、环境修复及污水处理等领域具有广阔的应用前景（Qu et al.，2013；Gebre et al.，2019；Pirzada et al.，2019；Khalaf et al.，2023）。进入环境的NiO NPs 易被生物摄取，引发毒性胁迫从而影响动植物和微生物生长代谢。例如，NiO NPs可通过氧化应激诱导水生动物细胞毒性（Aziz，2021），还可能令番茄幼苗产生应激反应并诱发植物细胞死亡（Faisal et al.，2013）。对微生物而言，NiO NPs 可引起细胞不规则收缩和变形，对细菌产生显著抑制（Saleem et al.，2017）。50 mg·L-1NiO NPs 暴露导致微生物氨单加氧酶（AMO）和羟胺氧化还原酶（HAO）活性明显降低，活性氧（ROS）水平升高（Liu et al.，2023）。相较于其他纳米颗粒，NiO NPs 可能具有更大的毒性威胁。Nogueira et al.（2015）评估了NiO NPs 等3 种金属纳米氧化物的潜在生态毒性，发现NiO NPs 的生物毒性显著高于TiO2NPs 和Fe2O3NPs。

环境介质中的NiO NPs可通过径流和管网收集等途径进入各污水处理系统（Wang et al.，2017）。人工湿地（Constructed wetlands，CWs）作为一种成熟的生态处理系统，不可避免接纳待处理污水中的NiO NPs，其内部生态因子对NiO NPs 的响应可能导致湿地运行性能的变化。例如0.1—1 mg·L-1NiO NPs 长期暴露（120 d）抑制了CW 系统的脱氢酶等关键酶活性，降低了细菌多样性，改变了微生物组成，并明显抑制了氨氧化和反硝化功能基因的转录，从而导致TN、TP 去除率分别降低15.3%—17.6%和14.2%—27.8%（Xiao et al.，2021）。其他纳米氧化物在CWs 中的暴露表现出类似的胁迫效应。50—150 mg·L-1TiO2NPs 短期暴露即导致NH4+-N 和NO3--N 去除率降低23.9%—38.8%及26.5%—71.4%，且细菌损伤增加（Han et al.，2021）。15—90 nm ZnO NPs 显著抑制人工湿地反硝化微生物索氏菌属（Thauera），令NH4+-N 和TN 去除率降低15.3%—22.0%及3.8%—11.0%（王文悦等，2021）。此外，0.5—5 mg·L-1CuO NPs 暴露改变了罗河杆菌属（Rhodanobacter）、索氏菌属、硝化螺旋菌（Nitrospira）等氮降解微生物，降低了不动杆菌属（Acinetobacter）等聚磷菌丰度，从而抑制了CWs 脱氮除磷性能（Yan et al.，2023）。然而，现阶段鲜有研究讨论NiO NPs短期或长期暴露对湿地生态因子及运行性能的影响。另一方面，在时间尺度上继续提升NiO NPs的处理浓度以探寻湿地系统的耐受性与稳定程度未见报道。

基于此，本研究旨在探索稳定运行的人工湿地在NiO NPs 暴露下运行性能的变化及微生物的响应，揭示NiO NPs 暴露浓度对人工湿地生态功能的影响。本研究的结果可为探讨人工湿地生态技术应对NiO NPs长期胁迫的可持续性及可恢复性提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 纳米氧化镍分散液制备

本研究采用的NiO NPs（CAS 号：1313-99-1）购自中国上海阿拉丁试剂有限公司，平均粒径<30 nm，纯度>99.5%，密度=6.67 g·cm-3。制备50 mg·L-1NiO NPs 原液分散液的步骤如下：在1 L 合成废水中加入50 mg NiO NPs 粉末；25 ℃、250 W、40 kHz下超声处理0.5 h。分散液制备完成后采用Zeta 电位仪（Malvern，Zetasizer Nano ZS MPT-2）进行电位分布分析，悬浮液的Zeta 电位为 (-22.3±6.29)mV，具有良好的色散性。

1.2 试验装置与运行

本试验采用垂直潜流式人工湿地，搭建于东南大学四牌楼校区。湿地装置为圆柱形，高60 cm（上层35 cm，下层25 cm），直径15 cm，基质层总高55 cm，从上至下依次为：15 cm 厚粗砾石（粒径10—20 mm）、20 cm 厚细砾石（粒径5—8 mm）、20 cm 厚石英砂（粒径1—2 mm），湿地孔隙率为40.0%。湿地采用连续流进水，上端设置进水口，连接蠕动泵进水，底部设出水口。装置上层种植3—4 株长势相近的湿地植物黄菖蒲。

湿地运行初期，通过接种污泥给湿地基质挂膜。挂膜期间湿地间歇运行，HRT 为3 d，持续45 d。挂膜完成后装置采用蠕动泵连续进水，HRT 仍为3 d，进水流量为1.41 L·d-1，试验时间为2019年6 月至2020 年1 月，分为3 阶段：NiO NPs 加药前（前102—0 d）、10 mg·L-1NiO NPs 处理期（0—60 d）、30 mg·L-1NiO NPs 处理期（60—120 d）。

1.3 合成污水配制及水质检测

本试验参照Xiao et al.（2021）的研究配制人工合成废水为进水，分别以CH3COONa·3H2O、CO(NH2)2、(NH4)2SO4、KNO3，KH2PO4为COD、有机氮、NH4+-N、NO3--N、TP，对应理论进水质量浓度分别为200、4、15、6、3 mg·L-1。此外，进水还包括镁、铁等微量元素。本试验制备进水的药品纯度均为AR。加药前装置稳定运行102 d，投加10 和30 mg·L-1NiO NPs 后分别运行60 d，每3 天检测COD、NH4+-N、NO3--N、TN 和TP 进出水含量。本试验的水质检测方法参考国标方法（国家环境保护总局，2002）。

1.4 基质酶活性检测

本试验通过检测5 种基质酶活性以评估NiO NPs 暴露的生物毒性水平。脱氢酶（Dehydrogenase，DHA）、脲酶（Urease，URE）、磷酸酶（Phosphatase，PST）、氨单加氧酶（Ammonia Mono Oxygenase，AMO）、硝酸盐还原酶（Nitrate Reductase，NAR）。5 种基质酶的检测方法主要参考《土壤酶及其研究法》（关松荫，1986）和之前的研究（Hu et al.，2018；Wang et al.，2016a）。其中DHA、URE、PST 分别采用氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法、苯酚钠-次氯酸钠比色法和磷酸苯二钠法测定，AMO 和NAR 分别采用重氮偶合分光光度法及NO3--N 消耗分光光度法测定。

1.5 微生物群落结构检测

在加药前、10 mg·L-1和30 mg·L-1NiO NPs 处理3 阶段末期，分别从装置3 个深度（5、10、15 cm）的不同位置采集至少3 个基质样本，充分混合以确保样本能更准确地代表湿地内部的一般情况。使用OMEGA Soil DNA Kit（M5635-02）（OMEGA Bio-Tek，Norcross，GA，USA）提取DNA 后，进行高通量测序以调查和分析细菌群落的变化，其中上游引物为338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGC A-3′），下游引物为806R（5′-GGACTACHVGGGWT CTAAT-3′）。选择细菌16S rRNA 的V3—V4 区作为分类特异性片段，在上海派森诺公司的Illumina MiSeq PE300 平台上进行测序。

1.6 数据处理

通过SPSS 26（IBM，USA）软件对水质指标和酶活性进行ANOVA 和LSD 分析，如果P<0.05，则认为差异显著。通过 OriginPro 2021、Adobe Illustrator 2022 等软件绘制图形。

2 结果与讨论

2.1 纳米氧化镍暴露下出水水质动态变化

加药前和不同浓度NiO NPs暴露下人工湿地对有机物的去除情况存在差异。由图1a，加药前装置COD 平均去除率为67.2%，出水浓度呈波动下降趋势，表明有机物降解性能随着运行逐渐稳定而提高。据报道，NiO NPs 在水处理中具有促进COD去除的潜力，可能因为NiO NPs 是一种高导电性材料，可作为关键电子介质，推动碳代谢进程（Mishra et al.，2018）。本研究10 mg·L-1NiO NPs 暴露下（0—30 d 和30—60 d）出水COD 浓度持续下降，去除率分别提高16.5%（P=0.001）和20.8%（P=0.000），说明10 mg·L-1NiO NPs 暴露对有机物去除有一定刺激作用。而30 mg·L-1NiO NPs（60—120 d）暴露下出水COD 浓度存在较大波动，且COD 去除稳定性降低，但整体去除水平仍较加药前高5.24%—12.3%。

NiO NPs 暴露整体对湿地脱氮性能产生协同促进作用。从硝化过程分析（图1b），加药前出水NH4+-N 浓度逐渐下降，去除率随之上升，但因为前期装置不稳定，水质波动较大，加药前NH4+-N平均去除率为30.1%。投加10 mg·L-1NiO NPs 后（0—60 d）出水NH4+-N 浓度趋于稳定，去除率较加药前提高63.9%—66.4%（P=0.000），表明NiO NPs暴露60 d 可稳定刺激NH4+-N 转化，一定程度上强化硝化功能。Huang et al.（2020）认为低水平NiO NPs 可强化NH4+-N 去除，因为低剂量NiO NPs 可通过诱导相关酶合成和促进物质转移提高细菌活性，从而提高微生物脱氨效率（Zhang et al.，2017）。当NiO NPs 质量浓度提升至30 mg·L-1，出水NH4+-N 含量产生较大波动，30 mg·L-1NiO NPs 暴露前期（60—90 d）去除率较加药前提升53.0%（P=0.000），表明高浓度NiO NPs 胁迫对硝化的促进潜力降低，后期（90—120 d）去除率逐渐上升至92.9%（较加药前高62.8%，P=0.000），说明系统逐渐适应了高浓度NiO NPs 胁迫，恢复对NH4+-N 转化的促进，并重新趋于稳定。

从反硝化过程看（图1c），加药前至10 mg·L-1NiO NPs 暴露期间（前102—60 d）出水NO3--N 含量较稳定，平均去除率均高于90%。投加10 mg·L-1NiO NPs后NO3--N去除率较加药前略微降低1.65%—5.46%，说明10 mg·L-1水平的NiO NPs 对反硝化无明显影响。而当质量浓度提升至30 mg·L-1，出水NO3--N 产生较大波动，NO3--N 去除率陡然降低至32.6%—52.3%，两阶段分别较加药前低 44.7%（P=0.000）和64.4%（P=0.000），表明30 mg·L-1NiO NPs 显著抑制了湿地反硝化功能，影响系统稳定。研究显示NiO NPs的致毒机制主要为自身的纳米效应（Wang et al.，2016b），纳米毒性可能致关键酶活性降低，参与氮磷循环的功能微生物受抑制（Li et al.，2022）。其他研究也证明了NiO NPs 抑制反硝化速率，导致NO3--N 积累，这可能与NiO NPs 暴露下主要反硝化菌属相对丰度降低有关（Xiao et al.，2021）。

由图1d，由于出水NH4+-N 含量在总氮素中占主导，故TN 动态变化与NH4+-N 类似，出水浓度基本呈现加药前波动降低，10 mg·L-1NiO NPs 暴露后持续低水平，NiO NPs 剂量增大后先升高后降低的规律。投加10 mg·L-1NiO NPs 后（0—60 d）TN去除率较加药前提高22.3%—34.7%（P=0.000），且在暴露前期（0—30 d）TN 去除水平最高，为93.06%。表明NiO NPs 暴露60 d 可能促进TN 去除，但随时间推移存在波动。30 mg·L-1NiO NPs 暴露前期（60—90 d）TN 去除率降低，略高于加药前（高7.72%），这是NH4+-N 和NO3--N 去除率同时降低的结果。后期（90—120 d）TN 去除率逐渐上升至74.7%（较加药前高16.3%，P=0.002），但仍低于10 mg·L-1NiO NPs 处理的情况，说明尽管系统可逐渐适应高浓度NiO NPs 胁迫，恢复对TN 去除的促进，但高浓度水平NiO NPs 暴露下TN 去除率劣于较低浓度水平。

NiO NPs 暴露整体对湿地除磷性能产生促进作用，但不同投加剂量下促进程度与有机物降解和脱氮效果相反（图1e）。加药前湿地出水TP 含量波动下降，投加10 mg·L-1NiO NPs 后TP 出水浓度继续下降但仍存在较大波动；而30 mg·L-1NiO NPs 暴露后逐渐趋于稳定。从平均水平看，10 mg·L-1NiO NPs 处理时TP 去除率较加药前提高56.0%—61.1%（P=0.000），当质量浓度为30 mg·L-1时，60—90 d和90—120 d 的TP 平均去除率分别为91.2%和84.8%，较加药前高62.5%—68.9%（P=0.000），表明NiO NPs 也具有一定的除磷强化潜力，且在高浓度水平时更明显。

2.2 纳米氧化镍暴露下基质酶活性的变化

基质脱氢酶（DHA）作为传递氢的载体，有助于催化有机物氧化还原反应，促进有机物的生物降解（Chaperon et al.，2008；Jackson et al.，2013）。如图2a，相较于加药前，NiO NPs 暴露后DHA 活性先下降后上升，最后恢复至加药前水平，表明NiO NPs 短期暴露对DHA 活性产生抑制，但随时间推移DHA 活性逐渐恢复；10 mg·L-1和30 mg·L-1NiO NPs 暴露下DHA 相对活性较加药前分别低36.7%—51.5%、2.58%—23.2%，说明NiO NPs 对DHA 产生胁迫。

脲酶（URE）是一种C-N 键水解酶，能有效促进酰胺（如尿素）水解为氨及CO2，其活性可以反映土壤无机氮的供应能力，也可以用于表征土壤氮素状况（Fingler et al.，2004；王娟等，2008；Jośko et al.，2014）。如图2b 所示，10 mg·L-1NiO NPs 暴露下的两个阶段，URE 相对活性较加药前分别提高225%（P=0.002）和389%（P=0.000），且随时间增大。30 mg·L-1NiO NPs 暴露下URE 相对活性较加药前进一步提高456%—460%（P=0.000）。类似的，Ni NPs 对土壤URE 活性也产生刺激作用（Jośko et al.，2014）。

基质磷酸酶（PST）能促进有机磷化物的水解，其活性大小可以间接反映微生物对磷吸收能力的强弱（陈永华等，2010）。如图2c，投加NiO NPs后PST 活性先降低后提升，甚至高于加药前。10 mg·L-1NiO NPs 暴露前期（0—30 d）PST 相对活性较加药前降低44.7%，后期（30—60 d）比加药前高36.6%。随着暴露剂量提升至30 mg·L-1，在60—90 d 内PST 活性略有降低，但仍比未暴露高11.1%，而在30 mg·L-1NiO NPs 暴露后期（90—120 d）PST 相对活性较加药前高93.1%（P=0.033），表明NiO NPs 可协同促进PST 活性，且随时间推移效果更为明显。

从脱氮角度看，氨单加氧酶（AMO）和硝酸还原酶（NAR）分别对应硝化和反硝化的第一步。AMO 具有催化NH4+氧化为NO2-的能力（刘志培等，2004）。如图2d，投加NiO NPs 抑制了AMO活性，在时序上整体呈先下降后恢复的趋势。10 mg·L-1NiO NPs 暴露两时段AMO 相对活性较加药前分别降低46.7%和59.6%（P=0.019），而30 mg·L-1暴露下相对活性进一步降低至23.6%，较加药前低76.4%（P=0.015），表明NiO NPs 对AMO 的抑制可能随浓度的提升而增大，这与高浓度下NH4+-N去除率降低相符。30 mg·L-1NiO NPs 暴露后期（90—120 d）AMO 活性略有提升，对应的NH4+-N 去除也有所提升。

NAR 是硝酸盐代谢关键酶，促进NO3--N 还原为NO3--N，影响CWs 脱氮能力（王利群等，2003）。不同剂量的NiO NPs 对NAR 的影响存在差异。如图2e，10 mg·L-1NiO NPs 暴露下NAR 相对活性较加药前高73.0%—584%，而30 mg·L-1NiO NPs 处理时NAR 整体受抑制，在60—90 d 较加药前低33.7%，表明高浓度NiO NPs 抑制NAR 活性，削弱NO3--N 还原能力，从而导致NO3--N 去除率降低。

2.3 纳米氧化镍暴露下微生物群落结构的响应

微生物群落结构的变化可直接反映微生物对NiO NPs 暴露的响应。从门水平看（图3a），湿地运行期间丰度较高的微生物门包括变形菌门（Proteobacteria，48.1%—55.5%）、绿弯菌门（Chloroflexi ， 18.2% — 20.4%）、放线菌门（Actinobacteria，5.65%—13.4%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，5.62%—7.91%）等。变形菌门是自养反硝化菌的主要门（Han et al.，2020），10 mg·L-1NiO NPs 对变形菌门略有促进，而30 mg·L-1NiO NPs 令其相对丰度较加药前降低7.98%。绿弯菌门是污水处理系统中常见的丝状菌门（Jia et al.，2020），相对丰度在10 和30 mg·L-1NiO NPs 暴露下分别较加药前降低 6.09%和 10.4%。10—30 mg·L-1NiO NPs 还降低了酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）等微生物门的丰度，且抑制程度随NiO NPs 浓度升高而增大，表明高浓度NiO NPs 更具毒性威胁，可能对微生物群落结构带来不利影响。另一方面，NiO NPs 可刺激部分微生物活性，如在湿地系统中广泛分布的放线菌门和拟杆菌门（Chen et al.，2017；Xu et al.，2020），NiO NPs 暴露下放线菌门和拟杆菌门活性较加药前分别提升69.4%—137%和23.6%—40.9%，且随着NiO NPs 质量浓度从10 mg·L-1提升至30 mg·L-1，两者相对丰度进一步提升39.8%和14.0%，表明放线菌门和拟杆菌门可能是NiO NPs 耐受微生物，可在高浓度NiO NPs 暴露下富集。

图3 NiO NPs 暴露前后的微生物群落结构Figure 3 Microbial community structure with/without NiO NPs exposure

从纲水平看（图3b）， γ- 变形菌纲（Gammaproteobacteria）、 α- 变形菌纲（Alphaproteobacteria）、厌氧绳菌纲（Anaerolineae）是丰度较高的微生物纲，总占比为61.6%—69.9%。10 和30 mg·L-1NiO NPs 暴露下，α-变形菌纲相对丰度较加药前提高107%和168%，说明其对NiO NPs 的耐受性。而NiO NPs 对γ-变形菌纲和厌氧绳菌纲产生抑制，且两者在30 mg·L-1NiO NPs 暴露下的相对丰度较10 mg·L-1时进一步降低40.0%和8.2%，表明在10—30 mg·L-1范围内，随NiO NPs剂量增大，对γ-变形菌纲和厌氧绳菌纲的抑制作用增强。 另外， NiO NPs 处理令放线菌纲（Actinobacteria）和拟杆菌纲（Bacteroidia）丰度增大164%—212%和25.1%—60.6%，从而导致门水平上放线菌门和拟杆菌门相对丰度的提高。

从属水平看（图3c），10 和30 mg·L-1NiO NPs暴露对部分微生物属产生抑制，包括SBR1031、SC-I-84、脱氯单胞菌（Dechloromonas）、Candidatus_Competibacter等，较加药前分别降低60.6%—62.3%、28.4%—63.4%、32.6%—76.5%、29.5%—49.3%。另外，不同浓度NiO NPs 暴露对一些微生物属产生的影响相异。例如，在30 mg·L-1NiO NPs 胁迫时966-1、1-20、玫瑰单胞菌属（Roseomonas）、热单胞菌属（Thermomonas）等微生物属丰度降低。与之相反，假单胞菌属（Pseudomonas）、黄杆菌属（Flavobacterium）、食酸菌属（Acidovorax）等在10 mg·L-1NiO NPs 暴露下降低9.96%—70.3%，而在剂量提升至30 mg·L-1时相对丰度较加药前分别提升17.2%、323%、326%，表明这些微生物属逐渐适应NiO NPs 胁迫，属于耐受菌属。

进一步分析脱氮、除磷功能微生物以分析CW除污性能变化的主要机制。由图4a，对于脱氮微生物，氨氧化菌（AOB）亚硝化单胞菌（Nitrosomonas）受NiO NPs 促进，可能导致本试验中NH4+-N 去除率有所提升（图1b）；而亚硝酸盐氧化菌（NOB）硝化螺旋菌属则较加药前丰度降低84.0%—91.7%，说明NiO NPs对微生物氧化NO2--N存在抑制作用。尽管10 mg·L-1NiO NPs 刺激了一些反硝化细菌（DNB），如红细菌属（Rhodobacter）、热单胞菌属等（Xu et al.，2019），但对多数常见反硝化细菌（DNB）产生不利影响，如假单胞菌属、脱氯单胞菌、噬氢菌属（Hydrogenophaga）、黄杆菌属、食酸菌属、动胶菌属（Zoogloea）等（Gao et al.，2020；Zhang et al.，2020），相对丰度较加药前降低5.69%—70.3%，表明NiO NPs 对DNB 存在威胁，进而抑制湿地系统反硝化进程。Xiao et al.（2021）也观察到NiO NPs 对假单胞菌属、脱氯单胞菌、噬氢菌属等DNB 的抑制。当NiO NPs 质量浓度提升至30 mg·L-1，热单胞菌属由促进转为抑制（丰度较10 mg·L-1时降低97.0%），而脱氯单胞菌、噬氢菌属、动胶菌属抑制程度加剧（丰度较加药前降低42.6%—93.3%），而其他DNB 则有所提升，可能是部分功能微生物逐渐适应NiO NPs 胁迫，从而导致相对丰度增加。对于除磷功能菌（图4b），在10 mg·L-1NiO NPs 暴露后关键聚磷微生物（PAOs），如芽殖杆菌属（Gemmobacter）和不动杆菌属较加药前分别提高273%和100%，当NiO NPs 质量浓度提升至30 mg·L-1时，两者相对丰度进一步增大，较加药前高453%和600%，表明本试验中投加10—30 mg·L-1NiO NPs 对除磷功能菌产生刺激作用，且随暴露浓度增大，该作用更显著。这可能是PST 在投加NiO NPs 后（30—120 d）活性增强的原因（图2c），也解释了NiO NPs 暴露下TP 去除率的显著提升，且在高浓度时增幅更大（图1a）。

图4 NiO NPs 暴露前后装置功能菌属的相对丰度Figure 4 Relative abundance of functional genera in CW with/without NiO NPs

3 结论

1）NiO NPs 暴露对人工湿地COD、NH4+-N、TN、TP 的去除效果有一定程度提升。10 mg·L-1NiO NPs 轻微抑制NO3--N 去除，而在暴露60 d 后将质量浓度提升至30 mg·L-1，NO3--N 还原率显著降低，表明高浓度NiO NPs 抑制了反硝化过程。

2）对于基质酶，NiO NPs 整体抑制了DHA 和AMO 活性，而对URE 和PST 产生刺激作用；NAR活性在时间尺度上随NiO NPs 质量浓度从10 mg·L-1提升至30 mg·L-1时呈现先促进后抑制的趋势。

3）NiO NPs 暴露改变了湿地微生物群落组成，其中绿弯菌门受抑制，而放线菌门和拟杆菌门发生富集。对于功能微生物，NiO NPs 对AOB 产生刺激，但降低了NOB 丰度。脱氯单胞菌、噬氢菌属、动胶菌属等常见DNB 受NiO NPs 暴露抑制，可能是本试验中NO3--N 去除率降低的原因。而芽殖杆菌属、不动杆菌属等PAOs 丰度提升，进而促进了微生物除磷作用。