百草枯通过Wnt/β-catenin 信号通路调控Aβ 产生导致大鼠阿尔茨海默病样病变

刘涛，沈涛，李艳萍，罗洪文，张伟

1.云南大学附属医院急诊医学部，云南昆明 650021；2.红河州滇南中心医院/个旧市人民医院急诊医学部，云南红河 661000；3.西双版纳州人民医院门诊部，云南西双版纳 666100

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是临床常见的一种神经系统退行性疾病，是目前尚未攻克的医学难题。AD 是老年期痴呆最主要的类型，我国60 岁及以上老年人中约有1500 万痴呆患者，其中近1000 万是AD 患者。我国AD 患者呈现年轻化的增长趋势。AD 患者女性多于男性，60 岁以上妇女患AD 通常是相匹配男性的2～3 倍[1]。AD 的大脑病理特征包括含有细胞外淀粉样蛋白-β（amyloid β，Aβ）的老年斑或神经炎斑块和由高磷酸化Tau 蛋白（pTau）组成的神经原纤维缠结[2-3]。Aβ 是早期发现AD 的有吸引力的脑生物学标志物，因为它可能在AD 临床表现之前积累长达20 年[4]。

百草枯是许多除草剂中的活性成分，是全球应用最广泛的除草剂之一。百草枯作为除草剂在130多个国家广泛使用。大量百草枯死亡涉及致命摄入导致的自杀，也有与职业有关的疾病和死亡，发病率因国家和相关人口统计而异[5-6]。百草枯引起的呼吸问题（慢性咳嗽或呼吸困难、呼吸困难和喘息）与其剂量依赖性和在农业中使用百草枯增加的接触时间有关。百草枯的致命性导致全球30 多个国家制定了严格的法规。例如，百草枯自2007 年起在欧盟被禁止使用，目前在美国被限制使用。然而，百草枯在一些发展中国家的使用正在增加。虽然从2016年7 月1 日起中国已经禁止百草枯水剂的销售和使用，自2020 年9 月26 日起禁止百草枯可溶胶剂在中国境内销售、使用，但是对使用过百草枯的人来说，它所带来的影响却是长远的。因为百草枯进入体内后不会被人体代谢，所以会持续存在于体内，这导致了长期的毒性。除草剂和杀虫剂不当使用导致的神经病变的报道已经很多，但是关于百草枯的研究仍然不多。Chen 等[7]研究表明，百草枯暴露引起小鼠的联想学习和记忆受损与Aβ 水平升高直接相关。但目前对于Aβ 在体内升高的机制尚不明确，同时百草枯通过何种途径进入脑内导致Aβ 的水平异常同样未知。

血-脑脊液屏障作为循环系统物质入脑的最后一道屏障，其完整性是关系神经病变是否发生的关键。为探究百草枯是否会导致阿尔茨海默病，同时探究百草枯是否是通过破坏血-脑脊液屏障完整性导致这一结局的，本研究构建了百草枯中毒的动物模型，同时分析了作为细胞生命活动的关键信号通路的Wnt 信号通路在百草枯破坏血-脑脊液屏障完整性的机制[8-10]。

1 材料与方法

1.1 动物模型构建

选取9 只雄性SD 大鼠，体质量为（250±10）g。3 只大鼠随机设为对照组。另外六只大鼠设为百草枯组，一次性灌胃百草枯溶液20mg/kg，连续观察大鼠一般情况，造模后7d 检测实验指标。本研究涉及的动物实验由昆明医科大学支持，实验动物生产许可证号为：SCXK（滇）K2020-0004。

1.2 免疫印迹（Western blot）法

取对数生长期细胞，在6 孔板中加入细胞悬液，每孔约有细胞数的组织中加入含有蛋白酶抑制剂和PSMF 的RIPA 裂解液，置于均质器中。组织在低温下完全裂解。裂解后10000～14000×g离心3～5min，取上清放入新的EP 管中。根据BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，定量后进行免疫印迹检测。SDS-PAGE 分离的蛋白样品经过电泳转移到固相载体（如硝化纤维素膜）上。封膜后，用BSA 稀释的一抗在4℃下孵育过夜，在TBST 室温脱色摇床上洗涤2 次，每次10min。加入二抗稀释剂，室温孵育1～2h。用TBST 在室温下脱色摇床上洗涤两次，每次10min，进行化学发光反应。

1.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）

标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。分别设空白对照孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5 倍）。将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min，每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。450nm 波长依序测量各孔的吸光度（A值）。

1.4 统计学方法

免疫印迹条带用Image J 计算各孔条带灰度值，所有数据使用SPSS 22.0 统计学软件对数据进行统计分析，两组间数据比较使用t检验，三组间数据比较使用单因素方差分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫印迹法检测百草枯中毒会导致大鼠脑组织Aβ表达水平上调

Wnt 信号通路是维持血-脑脊液屏障完整性的关键分子机制。结果表明，百草枯处理之后神经系统稳态的关键蛋白Aβ42 的表达水平显著升高（图1，P<0.001）。

图1 免疫印迹法检测脑组织中Aβ42 的表达水平

2.2 免疫印迹法检测百草枯中毒会导致大鼠脑组织GSK-3β 表达水平上调

Wnt 信号通路是维持血-脑脊液屏障完整性的关键分子机制。SD 大鼠给予百草枯后，去除血-脑脊液屏障进行免疫印迹法检测。结果表明，百草枯处理后糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）表达水平升高（图2）。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和诱导型一氧化氮合酶（inducible isoform of nitric oxide，iNOS）的表达水平升高（图3C）。

图2 Western blot 法检测脑组织中GSK-3β的表达水平

图3 GSK-3β抑制剂拯救百草枯导致的血-脑脊液屏障损伤

2.3 GSK-3β作为百草枯破坏血-脑脊液屏障的主要因素

伊文思蓝染色结果显示，GSK-3β 抑制剂能一定程度地缓解百草枯导致的血-脑脊液屏障损伤，伊文思蓝染色液入脑的量减少（图3A）。同时GSK-3β 抑制剂处理后百草枯导致的Aβ 升高得到缓解（图3B），降低了炎症因子IL-1β、TNF-α 及iNOS 的表达水平。

3 讨论

百草枯作为广谱除草剂，其除草效果的良好作用使其大量推广使用。但是其对环境及人体也造成了难以恢复的损伤。由于其强大且急性的毒性，目前关于百草枯中毒主要集中在肺、肝脏等脏器的损伤研究，这也是急性百草枯中毒的重要靶点，但是其在环境以及人体中存量仍然是导致疾病的重要因素，特别是长期的百草枯暴露导致的神经系统疾病是不可忽视的[11-14]。Aβ42 可以在大脑中发生异常聚集和淀粉样蛋白生成，形成纤维状斑块，这是阿尔茨海默病的标志[15-16]。GSK-3β 作为细胞生长中的关键蛋白，参与细胞的多种生命过程，Yamaguchi 等[17]在体外试验中发现，抑制GSK-3β表达能促进病理状态下的血-脑脊液屏障的完整性。百草枯中毒的SD 大鼠的血-脑脊液屏障被破坏，伊文思蓝染色结果显示大量穿过血-脑脊液屏障进入大脑，这表明百草枯能改变血-脑脊液屏障结构，使血-脑脊液屏障的保护作用减弱，这将极大地促进神经系统性疾病的发生。

免疫印迹法检测结果显示，百草枯入脑后脑组织中Aβ42 的表达水平上调，这是阿尔茨海默病发生的关键蛋白。ELISA 结果显示，百草枯中毒SD 大鼠脑组织中炎症因子IL-1β、iNOS 和TNF-α 的表达水平上调，同时百草枯可以上调血-脑脊液屏障中GSK-3β 的表达水平。使用GSK-3β 抑制剂处理百草枯中毒SD 大鼠，伊文思蓝染色结果显示，GSK-3β抑制剂能显著增加血-脑脊液屏障的完整性，降低脑组织中Aβ42 的表达水平以及炎症因子的表达水平。本研究表明，百草枯可以通过上调GSK-3β 的表达导致血管破坏，最终破坏血-脑脊液屏障完整性，进一步导致百草枯入脑上调Aβ 的表达水平，使百草枯中毒动物产生阿尔茨海默病样病变。

阿尔茨海默病作为神经细胞性疾病，目前已知的发病假设包括教育水平、遗传、头部外伤及其他躯体性疾病等，外界毒素或其他物质导致的神经组织中最重要的屏障即血-脑脊液屏障的完整性破坏可能是诱发神经病变的重要原因，本研究也证实这一观点[18-21]。本研究的结论为阿尔茨海默病新的致病因素判定提供参考。