基于Fas/Fas L通路探讨象皮生肌膏对肛瘘术后模型大鼠创面细胞凋亡的影响＊

刘 颖，余 炼，尹园缘，詹 敏，邹巍莹，黄静雯，程 扬，宾东华＊＊

（1.湖南中医药大学第一附属医院 长沙 410007；2.湖南中医药大学 长沙 410208）

肛瘘是指肛管直肠在感染、损伤、异物、疾病等因素影响下所形成的与肛门周围皮肤相互贯通的一种感染性管道，临床表现为肛旁肿痛难忍、破溃流脓等，反复发作，经久不愈，可发于任何年龄，以20-40 岁青壮年相对高发[1]。有调查显示[2]，我国城市居民肛肠疾病发病率已达51.14%，肛瘘的发病率为0.43%。基于肛门部的特殊生理及解剖学特点，手术是目前肛瘘的首选治疗方式[3]。瘘管手术后的粪便污染是不可避免的，易导致的伤口愈合延迟，不仅给患者带来了沉重的身心、经济负担，更是给肛肠外科医生带来了巨大挑战[4]。因此，如何快速且有效地促进肛瘘术后创面愈合具有重要的临床意义。已有研究表明，凋亡机制见于创面修复的各个阶段，且创面愈合的快慢、优良等均与修复过程中细胞凋亡与增殖之间的平衡关系密不可分[5-7]。

象皮生肌膏为湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，以清末医家张山雷《疡科纲要》之经典膏方象皮膏为基础方化裁而来，内含象皮、当归、生地黄、血余炭、醋龟甲等成分，具有活血化瘀、祛腐生肌的功效，广泛应用于我院多种创面修复，生肌效果显著。课题组前期研究表明，象皮生肌膏能有效减轻肛瘘患者术后疼痛、水肿等症状，缩短创面愈合时间，具有良好的临床效果[8-10]。而通过动物实验研究发现该机制可能与提高创面组织中转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表达水平，降低白介素-8（Interleukin-8，IL-8）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）表达水平相关[11-12]。细胞凋亡已被证实与创面修复关系密切，而Fas/Fas L 通路作为细胞凋亡的经典外源性信号途径在针对肛瘘术后创面修复的相关研究中暂未见报道。为进一步探究象皮生肌膏促肛瘘术后创面愈合的作用机制，本研究拟从细胞凋亡相关通路及调控因子着手，通过构建肛瘘术后创面大鼠模型，观察象皮生肌膏对肛瘘术后大鼠创面愈合及细胞凋亡相关调控因子的影响，以期为象皮生肌膏的临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

选取36 只雄性SPF 级健康 Sprague-Dawley 大鼠，体质量200-220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0004。所有动物均饲养于湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心，温度24-26℃，相对湿度50%-70%。本实验操作经湖南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准（伦理编号：ZYFY20211104-04）。

1.2 药物

象皮生肌膏（湖南中医药大学第一附属医院制剂室制备，湘药制字Z20070276，药品批次20211212）。

1.3 主要试剂与仪器

Fas抗体、Fas L 抗体、Caspase-8抗体（湖南丰晖生物科技有限公司，货号分别为 Fab5301、Fab5305、Fab1938）；Cytochrome c（136F3）抗 体（美 国Cell Signaling technology公司，货号#4280T）；HRP标记山羊抗兔IgG、HRP 标记的山羊抗大鼠IgG、山羊抗小鼠二抗、DAB显色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号分别为GB23303、GB23302、G1214-100UL、G1212-200T）；TUNEL 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号C1090）；苏木素-伊红染色液（广州维格斯生物科技有限公司，货号3201121）；TRIpure（北京百泰克生物技术有限公司，货号RP1001）；BeyoRT II MMLV 反转录酶（上海碧云天生物技术有限公司，货号D7160L）；RNase Inhibitor（生工生物工程（上海）股份有限公司，货号B600478）；2×Taq PCR MasterMix（北京索莱宝科技有限公司，货号PC1150）；SYBR Green（北京索莱宝科技有限公司，货号SY1020）。

生物组织摊烤片机（武汉俊杰电子有限公司，型号JK-6）；生化培养箱（上海一恒仪器公司，型号LRH）；石蜡切片机（德国莱卡公司，型号RM2235）；全自动病理切片扫描仪（匈牙利3DHIESTECH 公司，型号Pannoramic MIDI II）；CaseViewer 2.4 扫描浏览软件（匈牙利3DHIESTECH 公司）；超速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号H-2050R）；真空干燥箱（上海SYSBERY 仪器有限公司，型号DZF-6050）；紫外分光光度计（美国Thermo 公司，型号NANO 2000）；荧光定量PCR 仪（韩国Bioneer 公司，型号Exicycler 96）。

2 方法

2.1 动物模型的建立

2.1.1 肛瘘模型的建立

适应性喂养1周后，36只SD大鼠予以构建肛瘘模型，实验步骤参照本课题组前期相关研究[13]。SD 大鼠采用2%戊巴比妥钠以40 mg·kg-1的剂量腹腔注射麻醉。待麻醉生效后，使用脱毛膏脱除大鼠肛周毛发，络合碘清洁并消毒肛周手术区域。大鼠取俯卧位，取50 mL 注射器针头，自大鼠肛门缓慢进入，穿过括约肌，针尖抵达据肛缘约1 cm 处，自9 点位肛缘皮肤穿出（时钟定位法），退出注射器针头，沿针头所致的通道放置直径约2 mm 的不锈钢钢丝，将钢丝尾端扭转固定，放置30天。

2.1.2 肛瘘术后创面模型的建立

钢丝挂线留置30 天后，随机选取27 只造模成功的肛瘘大鼠进一步构建肛瘘术后创面模型。麻醉生效后，使用0.1%络合碘消毒大鼠肛周手术区域，随后沿钢丝进行“瘘管切除术”，术后无菌棉球压迫止血，创面保持开放，将大鼠放回饲养盒，后续自由饮食，观察大鼠存活情况。剩余9只肛瘘模型大鼠持续钢丝挂线留置，不予以特殊处理。

2.2 分组及给药

27 只肛瘘术后创面模型SD 大鼠被随机分为以下3组：象皮生肌膏组、凡士林组、模型组，每组9只；剩余9 只肛瘘模型大鼠则纳入假手术组。创面模型建立次日，各组进行创面给药，给药前各组均予以络合碘消毒，生理盐水冲洗。象皮生肌膏组采用象皮生肌膏纱条覆盖创面；凡士林组采用凡士林纱条覆盖创面，后各组均盖上医用无菌敷料加以固定。模型组络合碘消毒，生理盐水冲洗后盖上医用无菌敷料固定。假手术组无特殊处理。每日给药干预1 次，连续给药干预10天。

2.3 创面愈合率

使用数码相机于干预后第3、5、7、10天，拍摄创面愈合情况，同时使用0.5 cm×0.5 cm 透明方格面积测量器测定创面面积，与造模的初始创面面积进行比较，获得各组创面动态愈合率。创面愈合率（%）=（初始创面面积-干预后第n天的面积）/初始创面面积×100%。

2.4 动物取材

给药干预10 天后，次日在2%戊巴比妥钠麻醉下取各组创面肉芽组织，假手术组在行“瘘管切除术”后取瘘管下创面组织，取材后的部分标本置于4%多聚甲醛固定，部分标本液氮速冻后置于-80℃冰箱保存用于进一步检测。所有大鼠取材后均遵循动物伦理福利处死。

2.5 指标检测

2.5.1 苏木素-伊红（Hematoxylin eosin，HE）染色检测创面组织病理变化

取创面组织标本石蜡切片，将切片脱蜡至水用于染色。随后将切片经苏木素染色、1%盐酸乙醇分化、碳酸锂返蓝、伊红染色。后经乙醇脱水，二甲苯透明，将切片用中性树胶封固。使用Pannoramic MIDI II 全自动病理切片扫描仪扫描玻片，CaseViewer2.4 扫描浏览软件查看玻片并采集病理图片，观察组织病理变化。

2.5.2 TUNEL染色法检测创面组织中细胞凋亡数目

创面组织石蜡切片经充分脱蜡和水化后，滴加20 μg·mL-1不含DNase 的蛋白酶K，于37℃下处理20 min。PBS 充分漂洗，滴加制备的50 μL TUNEL 检测液，37℃避光孵育60 min。PBS 洗涤3 次，滴加DAPI染核，室温避光孵育5min，PBS 洗涤后抗荧光淬灭封片液封片。切片置于显微镜下进行观察，可见凋亡细胞的细胞核呈绿色荧光，其他细胞核呈蓝色荧光。使用病理切片扫描仪、CaseViewer软件对玻片进行扫描、观察并采集图片，采用Image J软件，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数÷细胞总数×100%。

2.5.3 免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）法检测创面组织中Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c 蛋白的表达

将石蜡切片经脱蜡及水化后，置于盛有柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）的修复盒中，微波炉中加热进行修复抗原，8 min后拿出，冷却至室温，PBS 洗涤。将切片置于3% H2O2溶液室温孵育10 min，PBS冲洗。在切片中滴加5%羊血清，室温封闭20 min，PBS 洗涤。滴加稀释的一抗，4℃孵育过夜。复温洗涤后滴加100 μL 二抗，37℃孵育30 min，PBS 冲洗。滴加新鲜配制的DAB显色液显色，于显微镜下控制显色时间，阳性染色为棕黄色。将切片用苏木素复染，返蓝液返蓝，蒸馏水洗涤，经脱水、透明、封片后于显微镜下观察。使用全自动切片扫描仪扫描，在CaseViewer2.4 软件进行观察及图像采集，图片采用Image-Pro Plus 6.0 软件分析、统计IOD值。

2.5.4 实时荧光定量PCR（Real time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）法检测创面组织中Fas、Fas L、cyto-c mRNA的表达

取创面组织充分研磨后加入1 mL TRIpure裂解液，混匀后静置5 min，加入200 μL 氯仿，充分混匀后静置3 min，4℃ 12000 r·min-1离心10 min。取无色的水相于离心管，加入异丙醇，-20℃下过夜。4 ℃ 2000 r·min-1离心10 min，弃上清；加入1 mL 75%乙醇，4℃ 7000 r·min-1离心3 min，弃上清，静置5-6 min。加30 μL RNase-free ddH2O，静置2 min，使充分混匀溶解，由此得到样本总RNA。使用紫外分光光度计测定样本RNA 浓度。对得到的RNA 样本进行反转录得到对应的cDNA，随后进行实时荧光定量PCR 分析。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40 个循环；72℃ 1.5 min，40℃ 1 min，60℃-94℃ 1℃·s-1，25℃ 1 min。以β-actin 为内参。利用2-△△CT方法分析数据。引物由通用生物股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR引物序列

2.6 统计学分析

数据分析采用SPSS 25.0软件，作图采用GraphPad Prism 9.3软件，实验数据以均值±标准差（±s）表示。多组间比较采用单因素ANOVA 分析。P＜0.05 为具有统计学意义。

3 结果

3.1 造模情况

肛瘘造模期间各组大鼠未见死亡，参加造模的大鼠于肛周触及条索样管道，并可见脓性样分泌物，提示各组均造模成功。肛瘘术后创面模型造模期间各组大鼠未见死亡，各组造模成功。故实验结束时每组9只大鼠均存活，均纳入统计。

3.2 创面愈合情况比较

象皮生肌膏组、凡士林组和模型组大鼠药物干预后3、5、7、10 天的创面情况见图1，创面愈合率比较见表2。与模型组相比，象皮生肌膏组及凡士林组在干预后7、10天时显著促进伤口愈合（P＜0.01），且象皮生肌膏组创面愈合率明显高于凡士林组（P＜0.01）。

表2 象皮生肌膏对肛瘘术后大鼠创面愈合率的影响（±s，n=9，%）

表2 象皮生肌膏对肛瘘术后大鼠创面愈合率的影响（±s，n=9，%）

注：与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与凡士林组相比，&P＜0.05，&&P＜0.01。

干预后10 d 84.44±2.95##&&77.16±2.51##68.71±3.52组别象皮生肌膏组凡士林组模型组干预后3 d 17.14±1.16 16.53±1.19 16.32±1.14干预后5 d 29.08±2.25 28.25±1.45 27.86±1.69干预后7 d 50.26±2.08##&&47.21±1.89##44.02±2.35

图1 象皮生肌膏对肛瘘术后大鼠创面愈合的影响

3.3 伤口组织病理学变化比较

HE 染色结果如图2所示，象皮生肌膏组创面组织可见胶原纤维、成纤维细胞排列整齐，致密，组织中少量炎性细胞浸润，可见较成熟血管形成，未见组织出血，创面修复良好。凡士林组大鼠创面组织病理切片中可见新生肉芽组织形成，周围伴有较多炎性细胞浸润，创面修复程度低于象皮生肌膏组。模型组大鼠创面可见细胞排列紊乱，有明显组织出血及炎性细胞浸润。

图2 各组肛瘘术后大鼠创面组织病理学变化（HE，×200）

3.4 创面组织中细胞凋亡数目比较

细胞凋亡情况见图3、图4，与假手术组相比，象皮生肌膏组、凡士林组、模型组细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，象皮生肌膏组、凡士林组细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）；与凡士林组相比，象皮生肌膏组细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）。

图3 各组大鼠创面组织细胞凋亡情况（TUNEL染色，×200）

图4 各组大鼠创面组织细胞凋亡情况（±s，n=3）

3.5 创面组织中Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c 蛋白的表达

免疫组化结果如图5、图6所示，与假手术组相比，模型组、象皮生肌膏组、凡士林组创面组织中Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，象皮生肌膏组、凡士林组Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c 蛋白表达水平显著下降（P＜0.01）；与凡士林组相比，象皮生肌膏组Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白表达水平显著下降（P＜0.01）。

图6 各组大鼠创面组织Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白的表达情况（±s，n=3）

3.6 创面组织中Fas、Fas L、cyto-c mRNA 的相对表达量

RT-PCR 结果如图7 所示，与假手术组相比，模型组、象皮生肌膏组、凡士林组创面组织中Fas、Fas L、cyto-c mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，象皮生肌膏组、凡士林组Fas、Fas L、cytoc mRNA 表达水平显著下降（P＜0.05，P＜0.01）；与凡士林组相比，象皮生肌膏组Fas、Fas L、cyto-c mRNA 表达水平下降（P＜0.05）。

图7 各组大鼠创面组织Fas、Fas L、cyto-c mRNA相对表达量（±s，n=3）

4 讨论

中医对肛瘘有“肛漏”“痔漏”“穿肠漏”等称谓，认为其因湿热下注，局部气血淤滞所致，早于《五十二病方》中便载以“牵引切除法”，为外科手术治疗肛瘘的雏形[14]。至今肛瘘无法通过药物根治，国内外医生仍将手术作为肛瘘的根治手段[15]。而因部位的特殊性，肛瘘术后创面不予以缝合，呈开放性，在排便污染、局部感染等因素的影响下，术后创面多愈合缓慢，使得患者饱受痛苦，因此，寻求有效的方法以促进术后创面快速愈合始终是研究的热点。近年来诸多文献报道，中药外用具简、便、廉、验等优势，并通过发挥多环节、多靶点、多层次的综合作用，可有效促进术后创面愈合[16-19]。

中医学理论认为肛瘘术后局部经络血肉受损，气血运行受阻，加之湿热未尽，导致创面肌肤筋肉气血亏虚，无以为养，新肉难生，创面难愈，故肛瘘术后应注意补气活血，化瘀止痛，祛腐生肌[20]。本实验所采用的象皮生肌膏属祛腐生肌之代表性方药，由象皮、当归、生地黄、血余炭、醋龟甲、生石膏、炉甘石等药物组成，方中象皮止血止痛、敛疮生肌，炉甘石、生石膏清热解毒，当归补血活血、生肌止痛，血余炭化瘀止血，生地清热养阴、凉血止血，龟甲益肾养血，诸药配伍合用以达清热解毒、活血化瘀、祛腐生肌之效。本研究显示：与模型组相比，象皮生肌膏组及凡士林组在干预后7、10天时显著促进伤口愈合，且象皮生肌膏组创面愈合率明显高于凡士林组，病理学结果显示象皮生肌膏组创面组织炎性细胞少，胶原纤维和成纤维细胞排列较整齐，致密，创面修复情况优于模型组及凡士林组，表明象皮生肌膏可有效促进肛瘘术后创面愈合。

细胞凋亡作为机体重要的细胞死亡形式之一，存在于创面修复的全过程，通过平衡细胞生长并消除已经完成特定任务的细胞群，而不会引起组织损伤或炎症反应，推动创面愈合的进展[21]。创面愈合通常分为四大重叠且有序的阶段：止血期、炎症期、增殖期和重塑期[22]，其中增殖期是创面愈合的关键时期，通过细胞的快速增殖、迁移，新生肉芽组织逐渐去除炎症，填补创口缺损，继而老化形成瘢痕组织，使创面得以愈合。若增殖期肉芽组织中的细胞过度凋亡，则会导致愈合延迟，甚至不愈合，因此，通过调控肉芽组织中的细胞凋亡，或可达到促进术后创面快速愈合的目的[23-25]。本研究结果显示：与假手术组相比，象皮生肌膏组、凡士林组、模型组细胞凋亡率显著升高；与模型组相比，象皮生肌膏组、凡士林组细胞凋亡率显著降低；与凡士林组相比，象皮生肌膏组细胞凋亡率显著降低，表明象皮生肌膏可通过抑制创面组织细胞的凋亡，从而促进创面愈合。

凋亡信号的传递涉及到一连串的复杂级联反应，其中典型的死亡受体Fas 介导的凋亡通路及线粒体/细胞色素C（Cytochrome C，cyto c）介导的凋亡通路为调控细胞凋亡的重要内外途径[26]。当Fas与配体Fas L结合，Fas 通过三聚化激活并与Fas 相关死亡域蛋白（Fas-associatingviadeath domain，FADD）结合，使得Caspase-8/10 被 募 集，从 而 形 成 由Fas、FADD 和caspase-8/10 组成的死亡诱导信号复合物（Deathinducing signaling complex，DISC），从而导致Procaspase-8激活，进而引发Caspase 级联反应，最终导致细胞凋亡。而cyto c 是凋亡内部信号传导通路的关键调控因子，当细胞凋亡信号的刺激使cyto c 从线粒体内释放到细胞质，cyto c 与细胞凋亡激活因子1（Apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）结合募集并激活caspase-9，进而活化下游的效应子Caspase，引起细胞凋亡。此外，激活的Caspase-8 可以切割促凋亡蛋白Bid 为tBid，tBid 移位至线粒体，进而导致cyto c 介导的凋亡通路激活，使得内在及外在凋亡途径有效串联，扩大了凋亡信号[27-31]。本研究结果显示：与假手术组相比，模型组、象皮生肌膏组、凡士林组创面组织中Fas、Fas L、cyto-c mRNA 相对 表 达量及Fas、Fas L、Caspase-8、cyto-c 的蛋白表达水平显著升高；与模型组相比，象皮生肌膏组及凡士林组Fas、Fas L、cyto-c mRNA相对表达量及Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白表达水平显著下降；与凡士林组相比，象皮生肌膏组Fas、Fas L、cyto-c mRNA 相对 表达量及Fas、Fas L、caspase-8、cyto-c蛋白表达水平显著下降，表明象皮生肌膏可通过抑制Fas/Fas L 通路的激活，抑制细胞凋亡，利于创面愈合。

综上所述，本研究证实象皮生肌膏能抑制肛瘘术后创面细胞凋亡，促进创面愈合，其作用机制可能与抑制Fas/Fas L通路的激活有关。