石斛花挥发油脂质体的制备工艺研究

马 丹，尚书游，李文琦，王劲松，阮 军，李硕芳，马志国，何 虹

（1.荆楚理工学院农业生物技术研究所，湖北荆门 448000；2.湖北钟祥聚瑞食品有限公司，湖北荆门 431900）

0 引言

中药挥发油不仅在医学上有很大的应用价值，还是香料工业、日用食品工业和化学工业中的一种重要的原材料[1-3]。由于中药挥发油的理化性质不稳定，导致其相关制剂的质量控制难度增大，使得制剂的进一步开发和推广受到了限制。随着芳香类中药挥发油的提取分离和产品研制的改进，新技术、新方法的应用对中药挥发油相关制剂的研究与开发提供了技术支持。含挥发油的中药材被研发成滴丸、软胶囊、微乳、凝胶膏剂、微囊、微球、脂质体、聚合物胶束等多种中药挥发油新型制剂[4-7]，并建立了鼻腔给药、经皮给药、结肠定位给药等多种新型给药系统。铁皮石斛是名贵中药，其活性成分多糖、黄酮等是研究热点[8-10]，而铁皮石斛花挥发性成分的研究较少。有研究表明，石斛花中含有丰富的挥发油，且具有抗炎、抗氧化、抗衰老等药理作用[11-16]；有研究[17-21]从石斛花中提取出挥发油，并对石斛花挥发性化学组分进行定性定量研究，为石斛花挥发油功能产品的开发提供了理论依据。对石斛花挥发油脂质体进行初步研究，旨在提高其稳定性，为其进一步开发和应用奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

石斛花，荆楚理工学院种植；胆固醇，天津博迪化工有限公司提供；卵磷脂，天津福晨化学试剂厂提供；三氯甲烷（分析纯），茂名市润景化工有限公司提供；甲醇（分析纯），无锡市晶科化工有限公司提供；磷酸盐缓冲液（生化试剂），南通凯恒生物科技公司提供。

1.2 仪器与设备

TU-1901 型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；XD-2000B 型旋转蒸发器，上海贤德实验仪器有限公司产品；显微镜、数显恒温水浴锅，上海力辰邦西仪器科技有限公司产品；GL-23M型大容量高速冷冻离心机，湘仪仪器科技有限公司产品；SB25-12D 型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品。

2 试验方法

2.1 石斛花挥发油的提取

称取石斛花500 g，加入无水乙醇750 mL，搅拌 3 h 后用布氏漏斗抽滤。于40 ℃条件下将滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，浓缩液使用离心机以转速4 000 r/min 离心10 min，得到约4.0 mL 油液。装于具塞试管中于4 ℃条件下储存备用。

2.2 石斛花挥发油脂质体制备

取石斛花挥发油0.45 mL，卵磷脂0.45 g，胆固醇0.15 g 置于100 mL 圆底烧瓶中，加三氯甲烷10 mL 溶解，置于40 ℃水浴中搅拌溶解。于旋转蒸发器上旋转蒸发，使脂质在器壁上形成薄膜。真空干燥2 h，加入pH 值7.2 的磷酸盐缓冲液20 mL，通过超声处理30 min 后得到乳白色均匀混悬液。

2.3 石斛花挥发油含量测定方法

2.3.1 UC 测定波长的选择

将0.02 mL 的石斛花挥发油放入50 mL 容量瓶中，加入甲醇溶液，定容至刻度。用甲醇溶液作为空白对照，于波长200～400 nm 处进行紫外扫描。通过扫描图谱来确定石斛花挥发油的最大吸收波长。

2.3.2 绘制标准曲线

取石斛花挥发油2 mg 加甲醇稀释至50 mL，分别吸取0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL，用甲醇定容至10 mL。在石斛花挥发油的最大吸收波长处测定标准液吸收度，平行测定3 次。通过线性回归可得石斛花挥发油的回归方程。

2.3.3 石斛花挥发油脂质体的理化性质

（1） 外观。参照钱雪等人[22]的试验方法。

（2） pH 值。参照钱雪等人[22]的试验方法。

2.3.4 测定脂质体的包封率

吸取混悬液于离心管中，冰浴10 min，以转速19 000 r/min 离心30 min，取上清液，按“线性关系考查”项下测定样品的吸光度，测得游离挥发油的含量。根据下面的公式计算包封率[5]：

式中：W1——加入的石斛花挥发油的总量，mL；

W2——测得游离挥发油的含量，mL。

2.4 单因素试验

固定其他条件与药物用量，制备石斛花挥发油脂质体的过程中，以水化温度、卵磷脂含量、胆固醇含量、磷酸缓冲液体积为影响指标，由以上4 个单因素来观察石斛花挥发油脂质体的包封率与成型性，筛选出单因素制备石斛花挥发油脂质体的最佳结果。

单因素试验因素与水平设计见表1。

表1 单因素试验因素与水平设计

2.5 正交试验优化制备处方

通过水化温度、石斛花挥发油与卵磷脂配比、卵磷脂与胆固醇配比、磷酸缓冲液的单因素试验，选择脂质体包封率最高值附近的3 个水平，对石斛花挥发油脂质体的制备工艺进行优化，观察其包封率与成型性。

正交试验的因素与水平设计见表2。

表2 正交试验的因素与水平设计

3 结果与分析

3.1 最大吸收波长

石斛花挥发油的紫外图谱见图1。

由图1 可知，在波长260 nm 处有最大吸收度，故将此波长定为检测石斛花挥发油含量的波长。

3.2 标准曲线

测定石斛花挥发油梯度浓度溶液的吸光度，得到的标准曲线方程为Y=0.160 8X-0.013 6，R2=0.999 2，表明石斛花挥发油的质量浓度为2.4～7.2 μg/mL 时与吸光度呈良好的线性关系。

3.3 石斛花挥发油脂质体的理化性质

将脂质体放置在显微镜下，可清晰地观察到石斛花挥发油脂质体呈球形，其表面包裹着磷脂，结构完整，大小较为均一。这种球形的脂质体表明了石斛花挥发油脂质体的稳定性和结构完整性。为了更好地了解石斛花挥发油脂质体的性质，对其采用pH 计测试。在测试中，发现其pH 值在5～7，说明其具有良好的稳定性和缓冲能力。

石斛花挥发油脂质体显微镜下图见图2。

图2 石斛花挥发油脂质体显微镜下图

3.4 单因素试验结果

3.4.1 水化温度的影响

水化温度对包封率的影响见图3。

图3 水化温度对包封率的影响

由图3 可知，在水化温度为40℃时，脂质体的包封率最高，为62.72%；当水化温度超过40 ℃时，随着温度的升高，包封率降低。温度过高会导致脂质体破坏或不稳定，温度过低则会使脂质体难以形成水化温度，还会影响脂质体的质量。在一定温度范围内，随着水化温度的升高，脂质体的稳定性和均匀性均会增加，但超过一定温度后，脂质体的稳定性和均匀性会减弱。水化温度还会影响石斛花挥发油的释放速率。研究表明，在一定温度范围内，水化温度的升高会加快石斛花挥发油的释放速率，但超过一定温度后，石斛花挥发油的释放速率反而会降低。在制备石斛花挥发油脂质体时，选择合适的水化温度，以保证脂质体的稳定性、均匀性和石斛花挥发油的释放速率。

3.4.2 卵磷脂与胆固醇配比的影响

卵磷脂与胆固醇的配比的影响见图4。

图4 卵磷脂与胆固醇配比的影响

由图4 可知，随着卵磷脂与胆固醇配比的增大，脂质体的包封率逐渐升高后降低。当卵磷脂与胆固醇配比为3∶1 时，脂质体的包封率达到最高，为69.5%。试验表明，胆固醇和卵磷脂具有较好的协同作用，胆固醇可稳定双层膜结构。当卵磷脂与胆固醇的配比增加时，构成脂质体的磷脂含量减少，而高胆固醇会增加脂质体的亲水性，使得磷脂膜不结实，容易被破坏、渗漏，不利于脂质体的形成，从而造成包封率降低。

3.4.3 石斛花挥发油与卵磷脂配比的影响

石斛花挥发油与卵磷脂配比的影响见图5。

图5 石斛花挥发油与卵磷脂配比的影响

由图5 可知，石斛花挥发油与卵磷脂配比为3∶1时，脂质体包封率达到69.37%；石斛花挥发油具有较强的挥发性和生物活性，其含量的增加可以增强脂质体内药物的包封率，也会影响脂质体的稳定性，可能导致药物的泄漏。卵磷脂则可以增加脂质体的稳定性，但其含量过高也会降低药物的包封率。

3.4.4 磷酸缓冲液体积的影响

磷酸缓冲液用量对包封率的影响见图6。

图6 磷酸缓冲液用量对包封率的影响

由图6 可知，在磷酸缓冲液用量为10 mL 时，脂质体的包封率最高，为47.54%，包封率随磷酸缓冲液增加而降低。当磷酸缓冲液的体积过大时，会导致溶液中石斛花挥发油脂质体的浓度过低，从而影响提取效率。当磷酸缓冲液的体积过小时，溶剂的浓度过高，可能导致石斛花中的油脂质体不能完全溶解，同样影响提取效率。磷酸缓冲液的用量越高，可提高溶剂的溶解能力，使得石斛花中的油脂质体更容易溶解，有利于提取。

3.5 正交试验结果

以脂质体的包封率为指标进行正交试验，正交试验2，4，5，7 的包封效果较好，分别为51.92%，56.45%，43.55%，52.07%。正交试验的最佳水平为A2B1C2D2，即水化温度为40 ℃，卵磷脂与胆固醇配比为1∶2，挥发油与胆固醇配比为3∶1，磷酸盐缓冲溶液pH 值为7.2，用量为10 mL 时，石斛花挥发油脂质体的成型性最好，包封率最佳，为56.45%。试验结果表明，卵磷脂的含量对石斛花挥发油脂质体的包封率和成型性均具有显著影响。

根据上述筛选得到的最佳工艺进行验证试验，制备3 批脂质体样品，测得石斛花挥发油脂质体包封率平均值为57.37%。

正交试验结果见表3。

表3 正交试验结果

4 结论

通过薄膜分散法研究石斛花挥发油脂质体配方中不同成分的比例和外在影响因素可知，石斛花挥发油与卵磷脂的配比对脂质体的制备、包封率和成型性的影响较大。当水化温度为40 ℃，卵磷脂与胆固醇配比为1∶2，挥发油与胆固醇配比为3∶1，磷酸盐缓冲溶液pH 值为7.2，用量为10 mL 时，石斛花挥发油脂质体的成型性最好，包封率最佳为56.45%。