鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备及其免疫保护效果研究

2024-01-19姜肖军郭亚男何生虎

家畜生态学报 2024年1期

姜肖军,郭亚男,何生虎

(宁夏大学农学院,宁夏银川 750021)

鸡滑液囊支原体病是鸡滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae,Ms)引起的一种以渗出性滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎为主的一种急性或慢性传染病,常发于1～4月龄鸡群,主要危害蛋鸡和肉鸡,导致产蛋量和蛋品质下降、生长发育迟缓和胴体降级[1],Ms常常会结合其他致病因子使鸡病情恶化,死亡率增加。Ms主要通过接触进行传播,一旦感染终身带菌,对于蛋鸡养殖来说,垂直传播是Ms流行、无法净化的一个重要原因。若雏鸡群中有经垂直传播的带菌雏鸡,该病可在短时间内蔓延至整个鸡群,发病率高达90%～100%。流行病学调查显示,Ms在全球不同地区蛋鸡群中的感染率非常高,蛋用种鸡场的阳性率可达70 %,该病的发病率近些年在中国呈逐年上升趋势。目前对于该病尚无有效的治疗手段,药物治疗虽然能取得一定效果,但无法彻底根除Ms[2]。加上近些年抗生素残留和耐药性问题的不断加重,使药物治疗在生产中的使用越来越受到限制,所以,研制有效的疫苗成为该病防治的一个重要突破口。目前国内尚无针对该病的有效疫苗上市,只有澳大利亚有经突变选育的一种弱毒苗[3],该疫苗是活苗,免疫后虽不会引起鸡体发病,但会永久性的根植于鸡体内,这明显不利于养殖场的支原体清除计划,因此在有些国家该疫苗被禁用。本研究利用Ms菌株Q5-2经灭活处理制成Ms灭活疫苗并对该疫苗进行安全性和不同剂量下免疫后的效果评价,以期为该病灭活疫苗的研究提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 主要试验材料

MsQ5-2菌株由宁夏大学临床兽医实验室分离并保存;20日龄海蓝褐雏鸡 50只(无Ms感染),由宁夏某禽业有限公司提供。Marcol-52白油佐剂购自南京天邦生物科技有限公司;鸡滑液囊支原体抗体检测试剂盒(编号为CK118)购自北京爱德士元亨生物科技有限公司;改良Frey氏培养基购自北京中海生物科技有限公司;普通营养琼脂培养基和鲜血琼脂培养基均购自青岛海博生物科技有限公司。

1.2 Ms灭活疫苗的制备

将本实验室保存Ms Q5-2菌株复苏后进行扩繁培养,期间用颜色单位变化法(CCU)测定菌体浓度,待菌体浓度达到109CCU以上时在菌液中加入终浓度为0.4%的甲醛,于恒温培养箱中灭活72 h。离心后,用PBS洗涤3次后重悬为原体积的1/10即得Ms抗原悬液,用核酸蛋白测定仪测定其蛋白含量,然后加入等体积白油佐剂用超声波破碎仪使其完全乳化,制成油包水型油乳疫苗。保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.3 灭活疫苗质量检测

将1.2中得到的抗原悬液接种于改良Frey氏固体培养基、普通琼脂培养基和鲜血琼脂培养基中,分别于37 ℃ CO2培养箱中培养2～7 d,根据其生长情况来鉴定其灭活效果以及是否含有活菌;选取健康小鼠10只、蛋鸡5只,将疫苗以肌肉注射的方式注射于动物体内,小鼠0.2 mL/只,蛋鸡0.1 mL/只,观察1周并记录其健康状况。

1.4 蛋鸡的分组与免疫

选取Ms抗体检测结果为阴性的蛋鸡40只,随机分为4组,每组10只,分别为低剂量组(P1)、中剂量组(P2)、高剂量组(P3)和阴性对照组(P0),对照组单独饲养。预饲1周后进行基础免疫,经胸腹部肌肉注射,剂量为P1组0.05 mg/只;P2组0.10 mg/只;P3组0.15 mg/只;P0组注射0.50 mL生理盐水。加强免疫时间分别在首免后第4周和第6周进行,注射剂量与首免相同。

1.5 抗体水平的检测

基础免疫前1周开始,每周固定时间采血1次并分离血清,编号并保存于-20 ℃冰箱中备用。按照Ms抗体检测试剂盒说明书对血清进行检测。

1.6 疫苗保护效力试验

三免后第8周所有试验动物均用MsQ5-2强毒(109CCU /mL )攻击,每只鸡滴鼻500 μL,滴眼200 μL,连续攻毒3 d。攻毒后连续15 d观察鸡的临床症状并记录直肠温度,判断是否发病的标准为:抗体检测为阳性、病鸡出现跛行的同时伴有鸡冠苍白、排绿色稀便及罗音3个症状中的任何一个症状即可判断为发病。计算每组鸡攻毒后的保护率。并分别于第0、5、10、15天采集咽拭子进行Ms分离培养试验[4]。保护率=(P0组发病数-该组发病数)/P0发病数×100%)

1.7 统计学分析

采用Excel (Microsoft Office 2010)软件对数据进行初步统计,各组试验数据以平均数±标准误表示,组间的差异比较采用方差分析,数据分析应用SPSS 20.0软件,P<0.05被认为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 灭活疫苗质量检测结果

经核酸蛋白测定仪检测,所得抗原浓度为0.8 mg/mL,加入等体积的白油佐剂后,灭活疫苗最终浓度为0.4 mg/mL。将抗原悬浮液接种于改良Frey氏培养基中,于37 ℃ CO2培养箱中培养4～7 d,未见有“煎蛋样”菌落出现,说明灭活完全。将抗原悬浮液接种至普通琼脂培养基和鲜血琼脂培养基中,37 ℃培养2～4 d,未见有杂菌生长。注射疫苗后,小鼠及蛋鸡,采食正常,精神状况良好;注射部位未见有红肿、化脓现象出现。检验结果均符合疫苗制作要求,表明疫苗安全可靠。

2.2 抗体水平的检测

首免后收集的血清经Ms抗体检测试剂盒检测结果显示,首免1周后即可检测到抗体的产生,试验组中3个剂量组血清抗体转阳率为100%,对照组试验期间抗体一直为阴性。在第2次加强免疫前,3个剂量组抗体效价的变化趋势基本一致;第2次加强免疫后P1组抗体效价持续上升并于首免后第12周时达到峰值1∶158 000,之后抗体效价开始缓慢下降。P2组和P3组在第2次加强免疫后,抗体效价经过短暂的上升在首免后第8周时达到峰值,分别为1∶10 200和1∶6 400。达到峰值后开始下降,高剂量组的下降快于低、中剂量组(P<0.05)(图1)。经统计学分析,首免8周后不同剂量组之间差异显著(P<0.05)。说明低剂量组的免疫效果最好。

2.3 灭活疫苗免疫保护效果

采用滴鼻、滴眼方式对免疫后的试验组和对照组进行攻毒,观察其健康发病情况并计算保护率,分别于攻毒后第0、5、10、15天采集咽拭子进行Ms分离培养试验,并记录每天15:00的肛温。结果显示,攻毒后对照组体温迅速上升,然后维持在43 ℃左右,并表现出明显的临床症状,发病率为100%;试验组中3个剂量组攻毒后体温也迅速上升,但比对照组略低,第9天后体温迅速下降并趋于正常体温(见图2)。低剂量组发病率为0,攻毒保护率为100%;中剂量组和低剂量组发病率为20%,攻毒保护率为80%。随着时间的推移,免疫后的3个剂量组攻毒后排毒动物的数量明显少于对照组(表1)。表明经该疫苗免疫后,蛋鸡对于强毒攻击具有良好的抵抗力,并对感染动物的排毒起到了一定抑制作用。

表1 Ms灭活疫苗免疫保护效果 Table 1 Protective efficacy of the inactivated Ms vaccine

图2 攻毒后体温变化趋势Fig.2 Trend of tempreture after challenge

3 讨论

目前,国内尚无针对Ms的有效疫苗,仅有澳大利亚有经突变选育的两株减毒苗Ms1和(ts+)Ms-H。

该疫苗的免疫效果和保护力均已得到相关研究的证实。但是由于是活苗且价格昂贵,目前在中国还没有得到广泛的推广和应用。大部分养殖企业对Ms的防治依然以药物治疗为主,因此研制一种安全有效的灭活疫苗,控制中国Ms感染流行的现状显得尤为重要。

本研究成功制备了Ms灭活疫苗,为了评价该疫苗的保护效果并探究其最佳免疫剂量,分3个剂量组对蛋鸡进行免疫后,进行了攻毒试验。结果证明该疫苗能刺激机体产生良好的免疫应答,并对强毒感染鸡只的排毒具有一定的抑制作用,综合评价后确定最佳免疫剂量为0.05 mg/只。机体的免疫应答至少受3个因素的影响:抗原、免疫佐剂和试验鸡本身情况,抗原剂量能明显影响免疫应答,抗体的浓度和抗体的效价水平,一般而言,在一定剂量范围内,免疫效果会随着抗原剂量的增加而增加,但过高的免疫剂量会引起机体出现免疫抑制[5-7]。相关研究结果表明,使用0.1 mg的鼠IgG为免疫原免疫试验鸡的免疫效果要比1 mg剂量好。目前得到大多数学者公认的是,抗原剂量在10～1 000 μg免疫效果最佳[8],笔者所选用的剂量也以此为基础。针对多次免疫中的最佳免疫间隔时间问题,存在着不同的见解和习惯,但大量研究表明为了获得高浓度抗体,第1次和第2次抗原注射的时间间隔至少为4周,以便有足够的时间产生免疫记忆[9]。故本研究中首免和二次免疫的时间间隔为4周。结果表明,3个剂量组经过3次免疫均达到了较高的抗体效价,说明灭活疫苗的免疫效果较好,与低剂量组相比,中剂量组和高剂量组在第2次加强免疫后抗体效价经过短暂上升后即开始显著下降。而低剂量组二次加强免疫后抗体效价持续上升,峰值达到的最高抗体效价为1∶158 000,高水平的抗体效价稳定持久。造成这一现象的原因可能是由于,第1次和第2次加强免疫时间间隔较短,这时鸡体内抗体仍处于较高的水平,再次接种剂量较大的同种抗原时,鸡体内大部分抗体与抗原发生中和反应,导致抗体水平的上升不太显著。疫苗保护效力试验表明,该疫苗对于强毒攻击具有良好的保护作用,其中低剂量组的保护率最高,为100%,高剂量组为80%,随着时间的延长攻毒后疫苗接种组从咽拭子中分离出支原体的概率明显低于对照组。这一结果的不同可能是由于攻毒时3个剂量组Ms抗体水平的不同引起的,攻毒是在第3次免疫后第8周进行的,此时P2和P3组的抗体水平已经明显下降,故对Ms的攻击只能部分保护。另外Ms一经感染终身携带,但不一定会发病,试验表明,感染1～4周龄的鸡接触健康鸡后数日,健康鸡的呼吸道中就能检测到Ms的存在,所以从鼻拭子中分离出Ms并不能表明疫苗不具有保护力。