miR-140-3p在大鳞副泥鳅雌雄性腺中的差异表达和调控功能的研究

吕晓洁,王伟伟*,郝瑞荣,刘少贞,陈 越,杨 琼,李欣欣,谢宇浩,孙 睿

(1. 山西农业大学 动物科学学院,山西 太谷 030801;2. 沁水县现代农业发展中心,山西 沁水 048200)

大鳞副泥鳅(Paramisgurnusdabryanus),俗名大泥鳅,为鳅科副泥鳅属的鱼类,是中国的特有物种。与多数鱼类相同,大鳞副泥鳅具有较明显的性别二态性,同日龄的雌鱼体重明显大于雄性[1],因此生产中全雌鱼养殖能带来更大的经济效益。

miR-140-3p在miRBase数据库中有大约23个物种208条相关序列注释,是一种在性腺中广泛表达的miRNA[2-4]。对小鼠睾丸和卵巢miRNA高通量测序发现,在发育中的XY小鼠性腺中miR-140-3p表达量显著增加,而miR-140-3p敲除后的小鼠表型与阻断控制睾丸间质细胞分化的Notch信号通路的表型十分相似,提示miR-140-3p可以靶向调控Notch信号通路中的基因以控制小鼠的睾丸间质细胞的数量,从而影响睾丸分化过程[5]。SOX9基因作为性别决定的重要调控基因,在睾丸索周围间质Leydig细胞中的高表达[6]可以启动睾丸的分化[7],而SOX9位于miR-140的上游[8],调节pri-miR-140的表达,从而激活其功能[9]。miR-140在高效氯氰菊酯暴露后的大鼠(Rattusnorvegicus)睾丸组织中过表达,研究显示miR-140通过靶向SF-1从而抑制STAR、P450SCC和3β-HSD等类固醇基因的表达[10],一定程度说明了miR-140对类固醇激素的影响。虹鳟鱼(Oncorhynchusmykiss)性腺组织的小RNA测序结果显示miR-140在成熟精巢组织中显著上调[11]。可见miR-140-3p参与性腺分化和性腺功能的发育调控,同时其表达会受到激素的调节。然而迄今为止关于miR-140-3p在鱼类性腺中的表达水平及相关功能的研究甚少。本研究运用qRT-PCR方法分析miR-140-3p在大鳞副泥鳅性腺中的表达特征,并对miR-140-3p靶基因进行预测和相关生物学分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试大鳞副泥鳅取自山西省太原市鱼种场,均为性征发育成熟2～3龄的成鱼,雌鱼体重25 g左右,雄鱼体重20 g左右,雌雄鱼各选6尾,麻醉后置于冰上解剖,取出卵巢和精巢组织,迅速放入液氮中速冻,然后转入-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 方法

1.2.2 cDNA合成 取适量总RNA,按照北京聚合美生物科技有限公司M5 MiRNA cDNA Synthesis Kit试剂盒的说明先进行加尾,再合成对应的cDNA,置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 miR-140-3p引物合成及荧光定量 miR-140-3p和内参(U6)[12]引物序列见表1,miR-140-3p序列来源于课题组对大鳞副泥鳅性腺的MiRNA测序数据库,使用miR-140-3p原序列未做碱基删减,交由上海生工公司合成引物;使用加尾法得到的cDNA为模版,按照M5 MiRNA qPCR Assay Kit(MF307-01)说明书的程序进行荧光定量反应,每个样本进行3次重复,其Cq值导出到Excel,使用2-ΔΔCt法计算样品中miR-140-3p的相对表达量。

表1 miR-140-3p及内参U6的引物序列Table 1 Primer sequences of miR-140-3p and reference gene U6

1.2.4 对miR-140-3p的预测靶基因进行生物信息学分析 由于鱼类miRNA靶基因预测数据库DIANA TOOLS (http:// diana. imis. Athena -innovation.gr/)和TargetScan (http://www. targetscan. org/)中未收录大鳞副泥鳅相关信息,只收录了斑马鱼(Daniorerio)的靶基因信息。在进行靶基因预测前,先在NCBI中下载到斑马鱼的miR-140-3p的序列,经比对,大鳞副泥鳅的miR-140-3p与斑马鱼的该miRNA序列完全一致,根据miRNA 不同物种间功能的保守性,利用DIANA TOOLS 和TargetScan等软件进行靶基因预测,将预测得出的结果进行Venny (https:// bioinfogp. cnb. csic.es/)比对,与利用miRanda[13]算法预测出的大鳞副泥鳅miRNA靶基因进行比较分析,得到交集的靶基因,再输入DAVID数据库(https:// david. ncifcrf. gov/ tools.jsp)进行GO和KEGG pathway分析,筛选出与鱼类性别分化和繁殖相关的靶基因。将DAVID处理后的GO和KEGG pathway相关的Category、Term、Genes count和P-Value等富集信息输入Hiplot(https:// hiplot.com.cn /basic/ bubble)网站,进行富集通路的作图。最后结合大鳞副泥鳅性腺高通量测序得到的转录组数据进行联合分析,筛选出目的靶基因。

1.2.5 miR-140-3p靶基因的引物设计和荧光定量利用NCBI的在线软件primer-BLAST(https://www. ncbi.nlm.nih. gov/tools/ primer -blast/),使用课题组对大鳞副泥鳅转录组测序得到的基因序列,对miR-140-3p的靶基因进行引物设计。查阅文献选择2个内参基因并进行进一步筛选[14],选择表达稳定的内参基因进行荧光定量的数据分析,引物序列见表2。引物的合成由上海生工生物技术有限公司完成。

表2 用于qRT-PCR分析的靶基因及内参基因引物序列 Table 2 Primers of target genes and reference genes for qRT-PCR analysis

使用M5 Super qPCR RT Kit with gDNA remover 试剂盒进行反转录,合成的cDNA置于-20 ℃保存。靶基因荧光定量使用2×Realtime PCR Super mix(SYBRgreen,with anti-Taq, MF013-05)试剂盒,按照说明书程序进行qRT-PCR检测。

1.2.6 miR-140-3p及潜在靶基因相对表达水平相关性分析 采用独立样本t检验法(Independent-samplettest),分析雌雄大鳞副泥鳅性腺miR-140-3p及潜在靶基因的相对表达水平,计算其差异显著性,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。使用SPSS 26软件对miR-140-3p和潜在靶基因的表达水平进行皮尔逊相关系数分析。使用Graphpad Prism 8.3.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 大鳞副泥鳅性腺中miR-140-3p相对表达量分析

miR-140-3p在大鳞副泥鳅的雌雄性腺中均表达, 精巢中的表达量显著高于卵巢(P<0.01)(图1)。

图1 miR-140-3p在大鳞副泥鳅雌雄性腺中的表达** 表示差异极显著(P<0.01)。下同Fig. 1 Expression of miR-140-3p in the gonads of Paramisgurnus dabryanus** indicate highly significant difference (P<0.01). The same below

2.2 miR-140-3p靶基因的预测及功能性分析

通过DIANA TOOLS 和TargetScan数据库预测的靶基因分别有137和3 316个,使用Venny软件找到25个交集靶基因(见图2)。这25个交集靶基因包含在利用miRanda算法预测出的大鳞副泥鳅miRNA靶基因中。

图2 DIANA TOOLS和TargetScan预测的miR-140-3p靶基因交集Fig. 2 Intersection of miR-140-3p target genes predicted by DIANA TOOLS and TargetScan

利用DAVID数据库,对交集靶基因进行GO富集分析,发现它们富集在细胞过程、交流和信号等条目中(图3)。

图3 miR-140-3p靶基因GO富集注释条目Fig. 3 GO enrichment annotations of miR-140-3p target genes

进行KEGG分析发现部分靶基因富集在繁殖相关通路中,如:CPEB4基因富集于孕激素介导卵母细胞成熟(progesterone-mediated oocyte maturation)和卵母细胞减数分裂(oocyte meiosis)通路,GDF9基因富集于卵巢类固醇通路(ovarian steroidogenesis),它们参与卵母细胞成熟分化过程;HSD17b和CYP19a1b基因富集于甾类激素生物合成通路(steroid hormone biosynthesis)(图4),它们是调控雌激素生成相关基因;而SOX9基因富集于cAMP通路(cAMP signaling pathway)参与雄性睾丸分化调控。将这5个与性别相关的靶基因与大鳞副泥鳅性腺转录组高通量测序结果进行联合分析,筛选出在雌雄鱼性腺之间表达量差距较大,且表达量趋势与miR-140-3p结果相反的2个基因CPEB4和GDF9基因进行下一步验证。

图4 miR-140-3p靶基因的KEGG信号通路分析Fig. 4 miR-140-3p KEGG signal pathway analysis of target genes

2.3 miR-140-3p与CPEB4、GDF9基因的关系

筛选出富集于孕激素介导卵母细胞成熟和卵母细胞减数分裂通路上的靶基因CPEB4,与卵巢类固醇通路上的靶基因GDF9进行下一步分析。在大鳞副泥鳅miR-140-3p预测的靶基因数据集里进一步分析miR-140-3p与靶基因CPEB4、GDF9的靶标关系,发现miR-140-3p种子区域与2个靶基因的结合类型均为6mer,靶标关系位点见表3。

表3 CPEB4和GDF9与miR-140-3p的靶标关系位点Table 3 Target relationship sites of CPEB4 and GDF9 with miR-140-3p

2.4 CPEB4和GDF9在大鳞副泥鳅雌雄性腺组织中的表达

β-actin引物特异性良好,但是在雌雄大鳞副泥鳅性腺中的稳定性较差,样本间的Cq值差距较大,不宜作为大鳞副泥鳅性腺组织的内参基因使用。18S RNA引物特异性和雌雄大鳞副泥鳅样本Cq值较为平均,18S RNA基因更适合作为大鳞副泥鳅性腺组织的内参基因。所以选择18S RNA作为内参进行荧光定量数据的分析。qRT-PCR结果显示,CPEB4和GDF9基因在大鳞副泥鳅卵巢和精巢组织中都有表达,且都表现出卵巢的表达量显著高于精巢(P<0.01)(图5)。

图5 CPEB4和GDF9在大鳞副泥鳅性腺中的表达Fig. 5 Expression of CPEB4 and GDF9 in the gonads of Paramisgurnus dabryanus

2.5 miR-140-3p与CPEB4、GDF9基因的相关性

miR-140-3p与靶基因CPEB4和GDF9的皮尔逊相关系数分别为-0.446和-0.515,存在显著负相关关系,进一步说明miR-140-3p与靶基因CPEB4和GDF9存在潜在的靶标关系,见表4。

表4 miR-140-3p与CPEB4、GDF9的相关性分析Table 4 Correlation analysis of CPEB4 and GDF9 targeted by miR-140-3p

3 讨 论

miRNA是细胞代谢、癌症发展等众多生物学过程中的主要调节因子,对于生物生殖相关器官发育和性别分化等方面在转录后水平的基因调控中发挥重要作用[15]。miR-140在小鼠雌雄性腺组织中的表达具有明显的性别二态性,其在睾丸组织中显著高表达,可以调节小鼠睾丸间质细胞的数量,从而调节睾丸的早期发育。在虹鳟中也发现miR-140在成熟的精巢组织中高表达[14]。本研究发现miR-140-3p在大鳞副泥鳅的雌雄性腺组织中均有表达,且精巢中的表达量显著高于卵巢,与前面的研究结果一致,说明miR-140-3p可能参与鱼类的性腺发育和繁殖相关的过程。

对大鳞副泥鳅miR-140-3p的交集靶基因进行KEGG Pathway分析,可以发现部分基因富集在繁殖功能和性腺发育相关通路上。CPEB4富集在卵母细胞减数分裂和孕激素介导卵母细胞成熟相关通路中,在卵子的发生和早期胚胎的发育过程中,蛋白质的产生完全依赖于储存在母体卵母细胞中的mRNA翻译,其过程与细胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白(cytoplasmic polyadenylation element (CPE)-binding proteins, CPEBs)介导的多聚磷酸化反应共同起作用的[16]。如向非洲爪蟾(Xenopuslaevis)注射抗CPEB抗体,非洲爪蟾卵细胞中CPEB耗竭,从而会阻止多聚腺苷酸化和减数分裂成熟,证明了CPEB对卵母细胞成熟的重要性[17]。CPEB4是在卵子发生中起重要作用的蛋白,可以控制卵子的成熟[18-19]。CPEB敲除(knockout, KO)小鼠(Musmusculus)中,雌性小鼠的生殖细胞分裂进程不会超过第一次减数分裂前期,卵母细胞KO小鼠不会发生多聚腺苷酸化和mRNA的翻译,生殖细胞的发育受到抑制,说明小鼠的卵子发生受到CPEB的控制[20]。本研究中CPEB4在大鳞副泥鳅雌雄性腺中均有表达,且在卵巢中显著高表达,qRT-PCR试验结果与高通量测序结果一致,说明在大鳞副泥鳅中,CPEB4基因在卵巢发育和卵细胞成熟过程中发挥着重要的作用。

miR-140-3p靶基因GDF9富集到卵巢类固醇生成相关通路中,GDF9是生长转化因子β(TGFB)超家族的成员。自1993年首次被鉴定以来[21],GDF9因其独特的卵母细胞特异性表达而日益受到关注,在多种脊椎动物的卵母细胞中发现了GDF9基因和蛋白的表达[22-27]。如:GDF9基因仅在斑马鱼的性腺中表达,在初级生长卵泡中表达最高,在卵泡发育过程中逐渐降低,在成熟卵泡中表达最低[28]。在齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)中,发现GDF9在皮质腺泡期卵巢和生精后期精巢中高表达[29]。在稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)性腺研究中,发现GDF9在卵巢中高表达,在长时间的双酚A的影响下稀有鮈鲫的卵巢出现不良发育,此时卵巢中GDF9表达的下降,证明了GDF9对稀有鮈鲫卵巢发育的影响[30]。在本研究中,GDF9在大鳞副泥鳅卵巢里显著高表达,与别的鱼类研究结果一致,说明GDF9参与大鳞副泥鳅卵巢的发育。

且CPEB4和GDF9在大鳞副泥鳅性腺中的表达量与miR-140-3p的表达显著负相关,说明CPEB4和GDF9与miR-140-3p存在潜在的靶标关系,在大鳞副泥鳅性腺中,miR-140-3p通过高表达抑制CPEB4和GDF9基因的表达,从而促进精巢的发育,miR-140-3p通过低表达,对CPEB4和GDF9基因的抑制作用消失,CPEB4和GDF9基因高表达,从而促进卵巢的发育。

4 结 论

本研究结果表明,miR-140-3p在大鳞副泥鳅雌雄鱼的性腺组织中均表达,且精巢中的表达量显著高于卵巢,靶基因定量结果显示CPEB4和GDF9的在卵巢中表达显著高于精巢,且表达量与miR-140-3p的表达显著负相关。这些结果在一定程度上说明miR-140-3p与其在性别和繁殖相关的通路上靶基因CPEB4和GDF9之间具有靶向调控关系,为后续进一步研究miR-140-3p的生物学功能提供了基础。