贻贝蒸煮液美拉德反应制备海鲜调味基料工艺研究及其挥发性风味分析

柯志刚,吴涛,陈慧,周绪霞,金友定,戴央章, 邓尚贵,周小敏,丁玉庭,刘书来,8,相兴伟*

1(浙江工业大学 食品科学与工程学院,浙江 杭州,310014)2(浙江省深蓝渔业资源高效开发利用重点实验室, 浙江 杭州,310014)3(国家远洋水产品加工技术研发分中心(杭州),浙江 杭州,310014)4(海洋食品精深加工 关键技术省部共建协同创新中心,大连工业大学,辽宁 大连,116034)5(嵊泗县景晟贻贝产业发展有限公司, 浙江 嵊泗,316000)6(浙江海洋大学 食品与药学学院,浙江 舟山,316000)7(浙江兴业集团有限公司, 浙江 舟山,316000)8(宁海县浙工大科学技术研究院,浙江 宁波,315600)

贻贝是一种以营足丝附着生活的双壳类软体动物,生长力强,产量高,在我国山东、浙江、福建等沿海省份均有大量养殖。贻贝肉富含氨基酸和维生素,其中牛磺酸的含量占总氨基酸的3%(质量分数),其对儿童生长发育有重要促进作用;贻贝中的多不饱和脂肪酸含量也很高,特别是二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)含量占总脂肪酸的31.65%(质量分数)[1],有益于防患老年人动脉粥样硬化。贻贝收获季节集中,采捕期短,产量大,采捕后若不及时处理,贻贝肉极易发生腐败变质。国内通常是将贻贝制成干制品、冷冻品以延长其储藏期。但在贻贝加工过程中会产生大量的蒸煮废液,每生产1 t贻贝产品,就会产生1.5 t蒸煮液[2]。将贻贝蒸煮液直接排放不仅会带来极大的环境压力,也造成了其中水溶性营养成分和蛋白质的浪费。研究发现,贻贝蒸煮液中富含蛋白质、氨基酸等物质,是一种极好的制作海鲜风味调料的原料。王欣等[3]将贻贝蒸煮液添加入酱油后制备了一种具有贻贝风味且营养价值高的酱油,为贻贝蒸煮液的综合利用提供了新的途径。也有学者通过对贻贝蒸煮液进行酶解,开发了海鲜调味酱。

美拉德反应是一种非酶促褐变反应,它是指在加热条件下,还原糖的羰基与氨基酸、肽或蛋白质的氨基发生反应,生成包括酮类、醛类、醇类、呋喃类等多种化合物的反应[4]。这些物质赋予美拉德反应产物独有的特征芳香风味。本实验以贻贝蒸煮过程中产生的蒸煮液浓缩后获得的浓缩液为基料,加入胰酶酶解制得酶解液,再向其中添加一定量的还原糖进行美拉德反应,以期获得贻贝风味调味料基料。综合应用单因素试验、Friedman排序检验、响应曲面结合模糊数学感官评价等方法,考察美拉德反应中还原糖添加量、反应时间、反应温度、反应初始pH等对美拉德反应产物风味的影响,优化得到了最佳反应条件,通过GC-MS对所得的反应产物的主要风味物质进行了分析。本研究结果为贻贝加工副产物的高值化利用提供了一定的借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本试验所用贻贝购自湖州市德清县长桥农贸市场。

试剂:胰酶,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;NaOH、HCl等试剂均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;木糖、葡萄糖均为食品级,山东齐鲁生物科技公司。

1.2 仪器

数显恒温水浴锅,上海邦西仪器科技有限公司;TU-1900分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;高速冷冻离心机,日本日立公司;Trace 1300-ISQ QD气相色谱-质谱联用仪(GC-MS),赛默飞世尔科技有限公司

1.3 酶解液的制备

将清理后的新鲜贻贝按料液比5∶1(g∶mL)加入纯水,沸水浴中加热15 min。待蒸煮液冷却至室温后,用纱布过滤2次。利用冻结-解冻方法对蒸煮液进行浓缩处理,以提高蒸煮液中蛋白质的浓度。将所得蒸煮液在-20 ℃下冻藏24 h,再进行常温水浴解冻。解冻完成后,9 400×g离心10 min,蒸煮液分离为上层的澄清液及下层的蛋白质沉淀物。澄清液通过超滤处理浓缩10倍后,与蛋白质沉淀物按2∶1(mL∶g)比例混匀,调节其中蛋白质含量至50 mg/mL。添加胰蛋白酶(酶活力200 U/mg)至2 000 U/g,50 ℃下酶解4 h。酶解完成后将酶解液置于100 ℃水浴锅处理10 min。灭活后的酶解液经9 400×g离心10 min,取上清液在4 ℃下保存备用。

1.4 美拉德反应产物的制备

吸取10 mL酶解液于试管中,按比例加入一定量(质量分数为1%、2%、3%、4%、5%)的木糖与葡萄糖(其比例为1∶1),调节初始pH(6.5、7、7.5、8、8.5、9)后密封,放置于油浴锅中(90、100、110、120 ℃)进行反应,反应(30、60、90、120、150 min)后立即进行冰浴,降至室温后4 ℃保存待测。

褐变程度测定参考侯钰柯等[5]方法并作适当修改,将美拉德反应产物稀释10倍,以水为参比,测定其在420 nm处的吸光度。

低分子香味中间体测定参考韩科研等[6]方法并做适当修改,将美拉德反应产物稀释100倍,以水为参比,测定其在280 nm处的吸光度。

1.5 Friedman排序检验

将美拉德反应液置于室温下平衡30 min,以避免温度对评估带来的影响。10名经过训练的感官评价员根据样品整体风味的可接受程度对样品进行排序打分,分值设置为1～5分,其中5分为最优,1分为最差,采用Kramer 检定法对样品的差异显著性进行分析。

1.6 美拉德反应条件响应面优化试验

根据褐变程度、低分子香味中间体及Friedman排序检验结果,对还原糖添加量、反应时间、反应温度、pH值4个因素进行优化,将-1、0、1编码为每个自变量的低、中、高试验水平,以模糊感官评价为响应值。利用统计软件Design Expert 8.0.6进行回归性分析,获得二次多元回归模型后对模型进行方差分析,用模型对美拉德反应液的感官评价进行分析和预测,得出最佳反应条件。响应面设计中各因素及其水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.7 模糊感官评价

1.7.1 建立因素集和评语集

因素集是指感官评定组成因素的集合,本试验因素集U={u1,u2,u3,u4}={色泽,海鲜味,焦香味,腥臭味};评语集指被评价的对象所处质量级别的集合,本试验以极优、优、良、差、极差为评语等级,评语集V={V1,V2,V3,V4,V5}={极优,优,良,差,极差},其中V1=5分,V2=4分,V3=3分,V4=2分,V5=1分。

1.7.2 建立感官评价因素集权重

通过0～4判别法确定美拉德反应产物评价过程中色泽、海鲜味、焦香味、腥臭味4个因素所占权重。对每个因素两两进行重要性比较,根据相对重要性打分:很重要-很不重要4～0分;较重要-不很重要3～1分;同样重要2～2分。根据评价员对各个因素所打分进行统计,得到各因素得分及权重因子。最后得到因素集的权重向量α=(α1、α2、α3、α4)=(0.167、0.354、0.278、0.201),其中α1+α2+α3+α4=1。

1.7.3 模糊矩阵及模糊变换

统计各因素中每个等级票数分布,采用模糊数学的方法处理评定结果,各个样品的感官结果为权重集α与所得的模糊矩阵A合成,即结果Y=αA。最后比较各样品的结果,得分高者即为风味质量模糊感官最佳。

1.8 挥发性成分的检测

取5 mL美拉德反应液置于20 mL顶空瓶中,加质量浓度为10-3μg/mL的1,2-二氯苯溶液30 μL,拧紧瓶盖,置于60 ℃恒温水浴锅中平衡10 min,后插入75 μm的PDMS SPME萃取头恒温萃取40 min,用GC-MS进行分析测定。

色谱柱采用DB-5MS毛细管柱(60 m×0.32 mm,1 μm),进样采用不分流模式。升温程序:起始温度40 ℃,以5 ℃/min的速率升温至100 ℃,再以2 ℃/min的速率升温至180 ℃,最后以5 ℃/min的速率升温至240 ℃,保持5 min。质谱条件:EI模式,离子源温度220 ℃,检测器温度250 ℃,传输线温度270 ℃,质量扫描范围35～500 amu,扫描速率3.0 scans/s,扫描时间间隔0.2 s。

1.9 数据处理

数据采用平均值±标准差表示(n=3),采用SPSS 26软件对相关数据进行方差分析,P<0.05具有差异显著性;采用Origin 2021绘制图表。

2 结果与分析

2.1 还原糖添加量的确定

还原糖添加量是影响美拉德反应速率的重要因素,同时对美拉德反应产物的风味和色泽也有重要影响[7]。通常以280 nm处的吸光度(A280)表征美拉德反应生成的低分子香味中间体含量,以420 nm处的吸光度(A420)表征美拉德反应终期产物含量[8]。本试验所添加的还原糖由木糖和葡萄糖复配组成,根据前期试验得知其比例1∶1时,反应液风味较佳。由图1可知,在1%～5%范围内,随着还原糖添加量的增加,美拉德反应低分子香味中间体含量显著增加(P<0.05),褐变程度显著增大(P<0.05)。若添加量从2%增加至3%,反应产物中低分子香味中间体和终产物的含量均显著增高(P<0.05)。若进一步增加还原糖含量至4%或5%,二者变化不再显著。

根据Friedman排序检验法对不同还原糖添加量的美拉德反应产物品质进行评价,秩次从小到大表示品质的从劣到优,样品进行显著性差异分析,查表2 Krammer顺位检定表评价员J=10,P=5(样品数)的临界值,上段用于确定样品间是否存在显著性差异,下段用于对样品的显著性差异进行分组。在P=0.05的显著性水平上,由R5%=18

图1 还原糖添加量对贻贝蒸煮液美拉德反应产物 褐变程度和中间产物生成量的影响Fig.1 Effects of the amounts of the added reducing sugar on the browning degree and the amounts of intermediate product in the Maillard reaction products of mussel cooking liquor注:不同字母表示不同组之间具有显著性差异(P<0.05)(下同)。

表2 Krammer顺位检定表(5%显著水平)Table 2 Krammer ranking test table (5% significant level)

表3 不同还原糖添加量下贻贝蒸煮液美拉德 反应产物的秩和Table 3 Rank sum of the Maillard reaction products of mussel cooking liquid with different amounts of reducing sugar

2.2 反应时间的确定

反应时间对美拉德反应生成的低分子香味中间体和终期产物的含量的影响如图2所示。由图可知,在前2 h内,随着反应时间的延长,反应液A420急剧增加(P<0.05),溶液颜色逐渐加深,表明类黑精等终产物含量随反应时间的增加而逐渐增加[9-10];进一步延长反应时间后,A420增加速率开始降低,反应速率开始下降。这与XIAO等[10]的研究结果一致。另一方面,随着反应时间的增加,美拉德反应产物中低分子香味中间体呈先上升后下降的趋势(P<0.05),在2 h低分子香味中间体生成量最高。

图2 反应时间对贻贝蒸煮液美拉德反应产物 褐变程度和中间产物生成量的影响Fig.2 Effects of the reaction times on the browning degree and the amounts of intermediate product in the Maillard reaction products of mussel cooking liquor

在P=0.05的显著性水平上,由R0.5 h=17

表4 不同反应时间下贻贝蒸煮液美拉德反应产物的秩和Table 4 Rank sums of Maillard reaction products of mussel cooking liquor at different reaction times

2.3 反应温度的确定

反应温度对美拉德反应的影响极为明显,温度较低时,反应进行速率慢,生成的有益风味物质较少;而当温度较高时,反应速率会急剧增加,生成的风味物质能显著改善产品风味,但反应终产物类黑精的快速积累会产生焦苦味,破坏产品风味[11]。由图3可知,低分子香味中间体的生成量随反应温度的升高呈现先增加后降低的趋势(P<0.05)。在110 ℃时低分子香味中间体含量最高,当温度为120 ℃时低分子香味中间体生成量降低,可能是糖类物质在温度较高时破坏程度加剧,以及蛋白质、肽发生热降解所致[12]。褐变程度(A420)则随着温度的增加而增加,表明随着温度升高,美拉德反应在末期产生的类黑精等物质生成量显著增加(P<0.05)。

图3 反应温度对贻贝蒸煮液美拉德反应产物 褐变程度和中间产物生成量的影响Fig.3 Effects of reaction temperatures on the degree of browning and the production of intermediates in the Maillard reaction products of mussel cooking liquor

在P=0.05的显著性水平上,R90 ℃=14

表5 不同反应温度下贻贝蒸煮液美拉德反应产物的秩和Table 5 Rank sums of the Maillard reaction products of mussel cooking liquid at different reaction temperatures

续表5

2.4 反应pH的确定

pH是影响美拉德反应的重要因素之一。美拉德反应速率随着pH的升高会加速Amadori重排产物及其下游褐变前体物质的形成与积累,有利于形成呋喃酮或还原酮,促进类黑精的生成[13]。而若pH值过高,会产生较多的NH3,从而对风味产生不利影响。由图4可知,在pH 6.5～9.0,随着反应初始pH增加,A420逐渐增大,这表明褐变程度增加,类黑精等美拉德反应终期产物含量增加;在pH 6.5～7.5,随着pH增加,A280不断增加。在pH 7.5～9,随着pH增加,A280不断减小。在pH 7.5时,A280最大。上述结果表明随着pH的增加,美拉德反应速率显著加快,但是会褐变严重且生成不具有香味的大分子物质,对反应产物的风味有不利影响。在pH 7.5时低分子香味中间体生成量最高,风味最佳。

图4 反应初始pH对贻贝蒸煮液美拉德反应产物 褐变程度和中间产物生成量的影响Fig.4 Effects of initial pH on the browning degree and the production of intermediates in the Maillard reaction products of mussel cooking liquor

在P=0.05的显著性水平上,由R8.5=13

表6 不同反应初始pH下贻贝蒸煮液美拉德反应产物的秩和Table 6 Rank sum of Maillard reaction products of mussel cooking liquor at different initial pH

2.5 响应面结果优化

2.5.1 回归模型的建立和方差分析

根据响应曲面试验设计得到29组试验方案,将各个等级的票数分布进行整理,利用模糊矩阵变换原理计算得各组的感官评价得分。基于单因素试验的结果,通过响应面试验优化了还原糖添加量(A)、反应时间(B)、反应温度(C)、反应pH(D)对美拉德反应产物感官评价的影响。响应面二次模型的ANOVA结果如表7所示。采用多元回归分析对数据进行分析,拟合模型方程如下:Y=88.37+0.39A+3.53B-5.24C-1.80D-3.71AB-3.52AC-5.74AD-4.33BC+3.02BD-4.26CD-14.29A2-12.11B2-23.66C2-16.66D2。

表7 响应面试验设计与结果Table 7 Response surface test design and results

续表7

美拉德反应液的感官评价的回归方程方差分析见表8。响应面拟合模型极显著(P<0.01和R2=0.955 7),表明该模型可靠性高,与数据拟合良好[14]。失拟项P=0.493 3>0.05,失拟项不显著,表明该模型可以反映制备条件对美拉德反应产物感官风味的影响,未知因素对试验结果的影响较小,残差主要来源于随机误差。反应温度(C)、A2、B2、C2、D2具有极显著的影响(P<0.01),反应时间(B)、AD也有显著性差异(P<0.05)。各因素的影响程度可分为:C>B>D>A。

表8 感官评价结果方差分析Table 8 Analysis of variance of sensory evaluation results

2.5.2 最佳工艺的验证

结合响应面优化试验分析,以感官评价得分作为评价指标,得到的美拉德反应最佳工艺为还原糖添加量3.01%,反应时间2.08 h,反应温度114.38 ℃,初始pH 7.49。在此条件下感官评价得分的预测值为89.01。为验证最佳工艺,向贻贝蒸煮液加入3%还原糖,调节pH值至7.5,在115 ℃下反应2 h,得到美拉德反应产物,并对其进行感官评价,结果见表9。经过模糊矩阵变换计算后得到感官评分86.62,与预测值较为接近,拟合较好,模型可靠。

表9 贻贝蒸煮液最佳美拉德工艺感官评价票数Table 9 Votes for sensory evaluation of the best Maillard process for mussel cooking liquid

2.6 美拉德反应前后挥发性物质变化分析

对贻贝蒸煮液及其美拉德反应产物分别进行了GC-MS分析,结果如图5及表10所示。未进行美拉德反应的贻贝蒸煮液中共检出26种挥发性物质,而在其美拉德反应液中共检出39种挥发性物质。美拉德反应前后挥发性物质数量、种类及含量均有较大差异。醛类物质在反应产物的风味中起主要作用,呋喃、吡嗪类物质则使其风味得到进一步提升。

图5 贻贝蒸煮液美拉德反应前后挥发性 物质种类及个数变化Fig.5 Changes in the types and numbers of volatile substances before and after the Maillard reaction

醛类物质具有较低的阈值,一般呈水果、青草等气味特征,在促成食品形成特征风味方面起重要作用[15]。贻贝蒸煮液中OAV>1的醛类物质包括异戊醛、庚醛、3-甲硫基丙醛、正辛醛、壬醛、反,顺-2,6-壬二烯醛。异戊醛具有麦芽味、苹果味,在Strecker降解中有较高的产率,是美拉德反应产物中重要的香气化合物[16]。3-甲硫基丙醛是鱼露中主要的风味化合物,具有马铃薯、麦芽香、果香等宜人气味[17-18]。壬醛具有脂肪香味,是美拉德反应产物中形成肉味的主要来源。庚醛[19]具有强烈的鱼腥味,是贻贝蒸煮液中不良风味的主要贡献者。这些醛类物质共同组成了贻贝蒸煮液特有的清香味和鱼腥味。而贻贝蒸煮液的美拉德反应物中OAV>1的醛类物质包括异戊醛、2-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、苯乙醛和壬醛。2-甲基丁醛作为常用香料,在低浓度时具有令人愉悦的果味,带有可可香和巧克力味,已广泛应用于食品工业中。苯乙醛有很强的渗透力,具有甜风信子、丁香气味。美拉德反应前后庚醛、正辛醛、反,顺-2,6-壬二烯醛含量显著下降,异戊醛、2-甲基丁醛、苯乙醛含量显著增高。这些醛类物质种类及含量的变化表明贻贝蒸煮液在经过美拉德反应后腥味得到显著改善,并且花香、果香等更加突出,使得产物的整体风味更加柔和。

表10 挥发性成分分析Table 10 Analysis of volatile components

醛类、酮类物质的相互作用可以为美拉德反应产物形成独特风味发挥重要作用[11]。酮类物质的气味阈值高于醛类物质,通常具有坚果、水果香。本研究中,美拉德反应后4-甲基-3-戊烯-2-酮(OAV>1)含量显著降低;异佛尔酮(OAV>1)含量略有增加,其具有薄荷香气,可作为食品香料。醇类物质阈值较高,对风味的贡献较小,1-辛烯-3醇[20]是贻贝蒸煮液中草腥味和清香味的主要来源,在贻贝蒸煮液美拉德反应产物中未检出,表明在反应产物中无风味贡献。

呋喃、吡嗪类化合物是由还原糖经脱水、分解及环化等一系列步骤形成。经过美拉德反应后的贻贝蒸煮液中共检出3种呋喃类物质和2种吡嗪类物质。其中2-正戊基呋喃OAV>1,其通常被认为是亚油酸酯氢过氧化物和亚麻酸氢过氧化物热降解形成[21],在美拉德反应产物中是焦糖风味的主要贡献者。

挥发性硫化物是硫醇、硫醚、噻吩、噻唑等的总称,由于挥发性硫化物香气阈值相对较低,即使在非常低的浓度下也能对食品的整体风味做出贡献[22]。本研究中二甲基硫醚OAV>1,其生成途径与硫胺素的降解有关,能够提供卷心菜味[23]。

3 结论

本研究以贻贝蒸煮液经酶解后的溶液为原料,通过美拉德反应制备海鲜基调味基料。以美拉德反应终产物和中间体含量、感官评价等为指标,通过单因素和响应面优化试验得到美拉德反应的最优条件为还原糖添加量3%、pH 7.5、反应时间2 h、温度115 ℃。所采用的模糊数学方法能够有效避免单纯感官评价的少数评价员错误信息,使得评价结果更加可靠。所制备的美拉德反应液风味浓郁,经GC-MS分析,产物中以醛、酮类物质为主,呋喃、吡嗪类等杂环化合物进一步加强了特征风味,整体风味和谐、丰满。本研究结果可为贻贝加工副产物高值化利用提供一定的借鉴和参考。