新疆乌鲁木齐市周边乳源金黄色葡萄球菌的污染和致病力评价

权子晨,贺腾飞,刘英玉

(新疆农业大学 动物医学学院,新疆 乌鲁木齐 830052)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是一种常见的食源性病原菌,人类因摄入了含有一种或多种肠毒素的金黄色葡萄球菌而导致食物中毒[1]。金黄色葡萄球菌及其分泌的毒素(如肠毒素)引起的食物中毒在细菌性食物中毒事件所占比例高达 33%～50%[2-3]。金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)被分为具有催吐活性的经典SEs和葡萄球菌肠毒素样蛋白新型SEs[4]。在世界各地的葡萄球菌食物中毒事件中经典SEs(sea、seb、sec、sed、see)被认为是葡萄球菌食物中毒的主要原因[5]。在新型SEs中,seg、seh、sei、ser、ses和set在灵长类动物模型中口服后也显示有催吐作用[4]。经典SEs是人源性金黄色葡萄球菌主要携带的种类,动物源及食源性金黄色葡萄球菌中检出多种新型SEs[6-7]。金黄色葡萄球菌还能产生多种致病因子,如溶血素、杀白细胞素、血浆凝固酶、耐热核酸酶等。金黄色葡萄球菌因引发奶牛乳房炎及子宫内膜炎等多种疾病,且患乳腺炎奶牛的生乳或乳制品会发生食物中毒,因此严重危害奶牛养殖业的健康发展[8-9]。本文通过对新疆乌鲁木齐市周边奶牛养殖场和挤奶厅的乳源样品进行金黄色葡萄球菌的污染调查,分离菌株进行SEs和多种毒力基因的PCR检测分析和耐药性调查,旨在评估乳源金黄色葡萄球菌污染和致病力,为监测金黄色葡萄球菌的暴发流行和危害提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集 2020年5月和6月在乌鲁木齐市周边地区的奶牛养殖场和挤奶厅采集了粪样225份,饲料41份,皮毛拭子54份,奶样37份,吸奶器拭子57份,合计乳源样品414份。

1.1.2 菌株 质控菌株为大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC29213 来自国家兽医微生物菌种保藏中心。

1.1.3 试剂 2×Taq Master Mix、ddH2O、DL2000 DNA Marker购自Takara宝日医生物技术有限公司;核酸染料、TE缓冲液、琼脂糖购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;Baird-Parker琼脂基础、7.5%氯化钠肉汤、金黄色葡萄球菌显色培养基、亚碲酸盐卵黄增菌液购自青岛海博生物技术有限公司。12种抗生素(恩诺沙星含量100%、环丙沙星含量100%、头孢噻呋含量100%、阿莫西林-克拉维酸钾含量86.6%/100%、头孢西丁含量98%、氨苄西林含量86.5%、庆大霉素含量54.6%、卡那霉素含量77.4%、阿奇霉素含量98%、氯霉素含量99.7%、万古霉素含量98%、磺胺异恶唑含量98%)购自中国兽医药品监察所。

1.1.4 仪器设备 博迅净化工作台SW-CJ-2FD购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂;恒温培养箱DHP-9162购自上海一恒科学仪器有限公司;高速离心机 D2012 plus SCILOGEX购自新疆伟博鑫生物科技有限公司;PCR仪购自美国BIO-RAD公司;水平电泳槽DYCP-31 DN购自北京六一生物科技有限公司;凝胶成像系统购自美国BIO-RAD公司;立式压力蒸汽高压锅购自上海申安医疗器械厂。

1.2 试验方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌的分离鉴定 按照国家标准《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验(GB 4789.10-2016)》[10]进行菌株的分离培养,样品按1∶10接种于7.5% NaCl肉汤中,培养16 h后划线接种于Baird-Parker琼脂平板上,培养24 h后挑取典型菌落划线接种金黄色葡萄球菌显色培养基,同时增菌后采用煮沸法[6]提取DNA模板备用。通过PCR方法扩增保守基因nuc进行鉴定,引物如表1。反应体系为25 μL,2×Taq Master Mix 13 μL,上下游引物各1 μL,DNA模板 2 μL,ddH2O 8 μL。反应条件:预变性95 ℃,5 min;95 ℃变性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环;72 ℃延伸10 min,16 ℃保存。取5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统观察结果。

表1 金黄色葡萄球菌毒力基因的引物序列和Tm值

1.2.2 金黄色葡萄球菌的毒力基因检测 参考胥兰[11]和Varshney AK[12]的文献合成Ses(sea、seb、sec、sed、see、sel、seg、seh、sei、sek、sem和seu),纤连蛋白结合蛋白fnbA和fnbB,溶血毒素hla和hlb,特异性凝集因子clfa,杀白细胞素pvl,毒素休克综合征毒素tst等19个毒力基因的引物(如表1),由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体系为25 μL,其中2×Taq Master Mix 13 μL,ddH2O 8 μL,上下游引物各1 μL,DNA模板 2 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,退火温度如表1的Tm值设定30 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环;72 ℃延伸10 min,16 ℃保存。取5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统观察结果。

1.2.3 金黄色葡萄球菌的耐药性调查 以美国临床实验室标准化组织(Clinical Laboratory Standards Institude,CLSI)的标准,采用琼脂稀释法测定金黄色葡萄球菌菌株对8类12种抗菌药物的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)值,判定标准根据CLSI标准。

2 结果与分析

2.1 乳源金黄色葡萄球菌的污染情况

从新疆乌市周边的乳源样品中鉴定出51株金黄色葡萄球菌,总分离率为12.32%(51/414)。由表2所示,225份粪样样品鉴定出19株金黄色葡萄球菌(分离率为8.4%),57份吸奶器拭子样品鉴定出13株金黄色葡萄球菌(分离率为22.1%),54份体表拭子样品鉴定出8株金黄色葡萄球菌(分离率为14.1%),37份奶样样品鉴定出7株金黄色葡萄球菌(分离率为18.9%),41份饲料样品鉴定出金黄色葡萄球菌4株(分离率为9.8%)。不同样品中的金黄色葡萄球菌污染情况差异较大,污染最高的是挤奶厅的吸奶器拭子样品,最低为牛奶养殖场的粪样样品。

表2 乳源样品分类和数量及金黄色葡萄球菌的检出率

2.2 金黄色葡萄球菌毒力基因检测

2.2.1 SEs的检测 对51株金黄色葡萄球菌进行12种肠毒素基因(sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、sel、sem、sek和seu)的检测,如表3所示有31株菌株携带一个或多个肠毒素基因,检出率为60.8%(31/51),经典SEs基因seb和sec的检出率为3.9%(2/51)和51.0%(26/51),sea、sed、see未检出。新型SEs基因she、sel、seg、sem、sei和seu的检出率分别为43.1%(22/51)、23.5%(12/51)、2.0%(1/51)、2.0%(1/51)、2.0%(1/51)、2.0%(1/51),sek未检出。

表3 乳源金黄色葡萄球菌的毒力基因检测结果

2.2.2 其他毒力基因的检测 由表3所示,金黄色葡萄球菌溶血毒素hla和hlb的检出率分别为52.9%(27/51)和84.3%(43/51)。纤连蛋白结合蛋白fnbB的检出率为7.8%(3/51),fnbA未检出。特异性凝集因子clfa检出率为90.2%(46/51),毒素休克综合征毒素tst仅检出1株为2.0%(1/51),杀白细胞素pvl未检出。

2.3 金黄色葡萄球菌耐药性调查结果

用琼脂稀释法对51株乳源金黄色葡萄球菌进行了12种抗菌药物的耐药性调查(见表4)。阿奇霉素和磺胺二甲嘧啶的耐药率最高分别是86.3%和84.3%,万古霉素、环丙沙星、阿莫西林-克拉维酸钾、氨苄西林、头孢西丁、头孢噻呋、氯霉素、卡那霉素的耐药率为49.0%、29.4%、27.5%、13.7%、11.8%、7.8%、5.9%、3.9%,对恩诺沙星和庆大霉素敏感。

表4 乳源金黄色葡萄球菌的耐药性调查结果

多重耐药金黄色葡萄球菌菌株共有34株,最高可达6重耐药(2株),其中3耐菌株最多有21株,在粪样、饲料、体表拭子、吸奶器拭子、奶样样品鉴定有9株、1株、5株、4株、2株金黄色葡萄球菌;4耐菌株有6株(11.8%),在粪样、体表拭子、吸奶器拭子样品鉴定有1株、1株、4株金黄色葡萄球菌;5耐菌株有5株(9.8%),在粪样、饲料、体表拭子样品鉴定有3株、1株、1株金黄色葡萄球菌;6耐菌株有2株(3.9%),在饲料和吸奶器拭子样品各鉴定出1株金黄色葡萄球菌(图1)。

图1 乳源金黄色葡萄球菌多药耐药菌株数量

3 讨 论

从乌市周边牛奶生产源头奶牛养殖场和挤奶厅进行金黄色葡萄球菌的污染调查,总分离率为12.3%,其中养殖场中粪样和饲草料的金黄色葡萄球菌分离率是8.4%和9.7%,挤奶厅中吸奶器拭子、体表拭子和奶样的金黄色葡萄球菌分离率是22.8%和14.8%、18.9%。与王韦华等[13]调查渭南地区奶牛养殖场生鲜乳中金黄色葡萄球菌污染结果一致,造成金黄色葡萄球菌污染与奶牛养殖环境、挤乳前的消毒工作、挤乳方式密切相关。顾其芳等[14]对上海地区4家奶牛场306份生牛乳中分离鉴定出32株金黄色葡萄球菌,分离率为10.5%。张玲等[15]对浙江杭州市某奶牛场 99 份生鲜乳中分离鉴定出5株金黄色葡萄球菌,分离率为5.1%。表明不同地区生牛乳金黄色葡萄球菌污染程度不同。

经典SEs是引发食物中毒的主要原因,近些年也报道了一些新型SEs引起的食物中毒[16],本研究中SEs的总检出率为60.8%,其中sec、seh和sel的检出率为51.0%、43.1%和23.5%。顾其芳等[8]对上海市生牛乳中32株金黄色葡萄球菌的经典SEs检测率为50.1%。杨慧君等[17]对宁夏地区231株牛源金黄色葡萄球菌中sea、seb和sec的检出率分别为27.7%、29.0%和5.6%。中国宁夏地区奶牛乳房炎乳源金黄色葡萄球菌中SEs基因检出率为71.4%,其中sei和sen检出率最高(44.0%)[18]。Morandi等[19]发现意大利67.1%的牛奶和乳制品源金黄色葡萄球菌编码了SEs。Nazari 等[20]研究发现伊朗库姆市乳源金黄色葡萄球菌检出率最高的SEs基因是sea、seb、seg、seh。本研究中溶血毒素hla和hlb检出率为52.9%和84.3%,董炜等[21]检测保定地区奶牛场中金黄色葡萄球菌hla和hlb检出率为97.5%和98.8%。此外,本研究与陈云[22]甘肃牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中clfa 检出率结果相近。根据结果显示,分离鉴定的金黄色葡萄球菌普遍存在致病性毒力基因,因此控制金黄色葡萄球菌感染对于牛奶安全具有重要意义。

一般来说,动物源金黄色葡萄球菌的耐药性较为严重,这与动物在养殖过程中长期使用抗菌药物有关。本研究中金黄色葡萄球菌对阿奇霉素和磺胺二甲嘧啶、万古霉素、环丙沙星、阿莫西林-克拉维酸钾的的耐药率分别是是86.3%和84.3%、49.0%、29.4%、27.5%,且呈现多重耐药的趋势。与任强等[23]和廖光华等[24]调查的南疆地区乳源中金黄色葡萄球菌的耐药性不同,任强等[23]调查的南疆地区乳源中金黄色葡萄球菌对青霉素G、红霉素和克林霉素的耐药率分别为72.0%、64.5%和58.9%。廖光华等[24]调查的南疆地区乳源中金黄色葡萄球菌对庆大霉素、诺氟沙星、红霉素、四环素和克林霉素的耐药率分别是9.9%、12.7%、30.9%、11.3%、12.7%,存在9株多重耐药性菌株。不同养殖场乳源金黄色葡萄球菌的耐药不同,但耐药性的增加会影响食品的安全或传递给人类,必须要引起重视。

4 结 论

从奶牛养殖场和挤奶厅的样品中分离鉴定出51株金黄色葡萄球菌,经典SEs以sec基因为主、新型SEs以seh和sel为主,同时携带较多的溶血毒素hla和hlb、特异性凝集因子clfa基因。分离鉴定的金黄色葡萄球菌对阿奇霉素、磺胺二甲嘧啶、万古霉素具有较高的耐药性。乌市周边奶牛养殖场和挤奶厅对牛奶质量安全具有严重的潜在危害。