球毛壳菌促生防病机制及应用研究进展

冯超红，李丽娟，张姣姣，王俊美，宋玉立，李好海，徐 飞*

（1.河南省农业科学院植物保护研究所/农业部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室，郑州 450002；2.河南省植物保护检疫站，郑州 450002）

由植物病原菌引起的病害是造成农业生产损失的重要原因之一。化学农药或肥料在植物病虫害防治和安全高效生产方面起到了至关重要的作用，但长期和大量使用化学农药或肥料对人类健康和生态环境构成了威胁。生物农药和生物肥料的产品研发为植物高效、安全和绿色生产提供了保障，已经得到人们越来越多的重视。毛壳菌属Chaetomium真菌是重要的植物病原菌生物防治菌之一，是腐生子囊菌中数量最大的类群之一，可以有效降解纤维素和有机物，对土壤中的其他微生物有拮抗作用[1]。该属中研究较多的为球毛壳菌C.globosum、角毛壳菌C.cupreum和螺卷毛壳菌C.cochliodes。其中，球毛壳菌对多种植物病害具有生物防治效果，能够分解利用植物纤维素，且产生很多具有生物活性的次生代谢物，在农业、医学和工业领域具有较大的应用潜能。以下将主要讨论球毛壳菌对植物病害的生防作用研究及应用概况。

1 球毛壳菌的形态学特征及分离来源

球毛壳菌属于子囊菌门Ascomycota、粪壳菌纲Sordariomycetes、粪壳菌目Sordariales、毛壳菌科Chaetomiaceae、毛壳菌属[2]。子囊壳为球形、卵形或倒卵形，顶端有孔口；具有交错丝组织的子囊壳壁；子囊壳上刚毛，没有分支，呈不规则的、松散卷曲状；子囊易消散，棍棒状或略梭状；子囊壳中含有子囊，每个子囊中含有8 个子囊孢子；子囊孢子呈褐色、柠檬状，长9～12 µm，宽8～10 µm，厚度为6～8 µm[3,4]。

球毛壳菌是常见的植物内生真菌，也广泛分布于空气、土壤等多种自然环境中。自Martin 和Moore[5]在1954 年报道燕麦上分离到的球毛壳菌和螺卷毛壳菌对镰孢菌属Fusarium和小麦根腐病菌（麦根腐平脐蠕孢Bipolarissorokiniana）有很好的拮抗作用以来，国内外研究者先后从毛白杨、白茅、美登木、油菜、鱼腥草、银杏、人参、侧柏和棉花等多种植物中分离得到了球毛壳菌，并对多种病原菌有拮抗作用[6-14]。如从银杏组织器官中分离筛选出16 株活性较强的内生真菌，其中球毛壳菌No.05 对玉米大斑病菌Setosphaeriaturcica的抑制作用最强[11]；从健康毛白杨的内生真菌中分离出球毛壳ND35 菌株，对多种病原菌表现拮抗作用，如污黑腐皮壳菌即杨树腐烂病菌Valsasordida、苹果树腐烂病菌V.mali和立枯丝核菌Rhizoctoniasolani等[6]；从油菜幼苗中分离筛选出具有抑菌活性的球毛壳菌YY-11，在室内平板上对油菜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum、立枯丝核菌R.solani、油菜灰霉病菌Botrytiscinerea和小麦赤霉病菌（禾谷镰孢F.graminearum）等有不同程度的抑制作用[9]；从棉花、鱼腥草和林下参中分离的球毛壳菌CEF-082、28 号和FS-01 等对棉花黄萎病菌Verticilliumdahliae、马铃薯早疫病菌Alternaria solani、辣椒疫霉病菌Phytophthoracapsici、西瓜枯萎病菌F.oxysporum和人参黑斑病菌A.panax等有很好的抑制作用[10,14,15]。除了抗菌活性，球毛壳菌还具有抗线虫、抗癌和抗氧化作用，例如从黄瓜幼苗中分离到球毛壳菌Ch1001，对根结线虫入侵具有抗性[16]；从绞股蓝的根部分离到了球毛壳菌CGMCC 6882，其产生的多糖具有抗癌活性[17]；从银杏、八角、杜仲和青檀中分离出的球毛壳菌均有较强的抗氧化活性[18-21]。

2 球毛壳菌的生防作用机制

植物内生真菌在植物体内经过长期进化，与寄主形成了协同的生态关系，通过分泌产生抗菌物质、促进宿主植物生长、诱导植物产生系统抗性、与植物病原菌竞争营养或空间以及重寄生等方面对植物病原菌产生抑制作用[22-25]。

2.1 产生抗菌等活性物质

产生抗菌活性物质是球毛壳菌拮抗植物病原菌重要机制之一。Heye 等[26]、Cullen 和Andrews[27]发现球毛壳菌孢子悬浮液及其培养提取物能够显著降低苹果黑星病的严重程度，减少苹果黑星菌Venturia inaequlis的侵染，并表明抗生作用在球毛壳菌对苹果黑星菌的拮抗中发挥重要作用。研究表明球毛壳菌的抗生作用主要体现在其代谢产物对病原菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用。球毛壳菌CH08、CH23 和ND35等发酵液对芒果炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides、苹果炭疽菌C.gloeosporioides、小麦根腐菌、玉米小斑病菌B.maydis、黄瓜灰霉病菌B.cinerea、辣椒疫霉病菌和玉米弯孢叶斑病菌Curvularialunata等的菌丝生长和孢子萌发有较强的抑制作用[28-30]。球毛壳菌CEF-082 的非挥发性代谢物对棉花黄萎病菌的菌丝生长和分生孢子产量有较好的抑制效果[14]。Aggarwal 等[31]得到的球毛壳菌Cg2、Cg3、Cg4 和Cg5 分离物通过抗生作用抑制禾旋孢腔菌Cochliobolussativus菌丝的生长，特别是Cg2 分离物具有较高的代谢物产量，抑菌作用最强。球毛壳菌株61239 发酵滤液对苹果腐烂病菌Valsamali分生孢子萌发和生长有显著的抑制作用[2]。

目前从毛壳菌属中分离得到了大量的天然产物，如细胞松弛素类、Azaphilone 类、吡喃酮类、醌类、二酮哌嗪类、苔色酸类和甾体类等，大多具有细胞毒、抗炎和抗病原微生物等活性[32]。在球毛壳菌中也分离出多种活性物质，最典型的就是球毛壳菌素类（chaetoglobosin）物质。球毛壳菌素是属于细胞松弛素的一类大环聚生物碱类[33,34]，而chaetoglobosin A 在球毛壳菌素家族中研究的最多，对多种植物病原菌有较强的抑制作用，如对米赫毛霉Mucormiehei、玉米大斑病菌、枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis、蜡状芽胞杆菌B.cereus、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus、大肠埃希氏菌Escherichiacoli、结核分支杆菌Mycobacterium tuberculosis、番茄灰霉病菌B.cinerea、油菜菌核病菌和橙色青霉Peniciliumavellaneum等均有较好的抑制作用[11,13,35,36]，对根结线虫也有较强的抑制活性[37]。分离到的其他球毛壳菌素类物质，如chaetoglobosins B、C-Z 等，也均有不同程度的抑菌活性[35,38]。

除了球毛壳菌素，在球毛壳菌的代谢产物中也分离到了其他种类的活性成分。研究较多的有嗜氮酮类（azaphilones），如chaetoviridins A、B、C、D、J 和K[39,40]及chaetomugilin A-S[41]，其中chaetoviridins A对病原菌有较强的抑制作用，对水稻稻瘟病菌Magnaporthegrisea和小麦叶锈病菌Pucciniarecondita的防效达80%以上，对番茄晚疫病菌P.infestans的控制效果达50%[42]；Zhang 等[43]研究了球毛壳菌CEF-082代谢物chaetoviridin A 对棉花黄萎病的生防机理，其能够引起棉花黄萎病菌的细胞坏死和菌丝变形，抑制黄萎病菌小菌核的萌发，并增强棉花防御反应。从球毛壳菌发酵液中分离鉴定得到的抗生素fuscoatroside、鞘氨醇和多糖等，均具有抗菌活性[44,45]，如鞘氨醇可抑制芸薹根肿菌Plasmodiophorabrassicae休眠孢子的萌发，对油菜根肿病有很好的生防作用[25]，多糖通过破坏细胞内膜并增加细胞渗透性，从而对大肠杆菌E.coli和金黄色酿脓葡萄球菌S.aureus产生拮抗作用[46]；球毛壳菌的发酵液中检测到含有吲哚乙酸（IAA）、麦角甾醇（Ergosterol）、赤霉素（GA）、玉米素（Zeatin）和brefeldin A （Ⅰ）等物质，对植物生长有较好的促进作用[47-49]。球毛壳菌ND35 粗酶液中的内切β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶等细胞壁降解酶对苹果炭疽病菌、杨树腐烂病菌、苹果树腐烂病菌的菌丝生长和孢子萌发均有明显的抑制作用[50,51]。另外，从球毛壳菌中还分离到了其他如吡喃酮类、醌类、二酮哌嗪类和甾体类等化合物，均有不同程度的抗菌和细胞毒活性[32]。

2.2 促进植物生长

内生真菌通过影响植物体内的物质代谢从而提高资源利用效率，如对植株中的氮代谢和积累有显著影响，从而提高植物对土壤氮的利用效率；通过改变植物体内碳水化合物的源库关系，进而促进光合作用；并通过调节植物激素的合成和代谢，促进植物生长[23]。球毛壳菌对大田小麦、辣椒、黄瓜、核桃、杨树、甘薯、拟南芥和板栗等作物的生长和产量均有不同程度的促进作用，例如对黄瓜的根长、株高、根鲜重和地上鲜重有促进作用，促进开花结果；对甘薯的单株产量提高4 倍；促进板栗侧根和毛细根的生长及开花；对杨树苗的根系活力、叶绿素含量、根系长度及株高等产生显著影响[24,47,49,52,53]。研究表明，球毛壳菌主要通过改善土壤肥力和微生物环境及产生生长调节物质从而发挥促生作用。球毛壳菌12XP1-2-3 拌种处理下苗期小麦根际土壤中芽孢杆菌和根瘤菌等有益菌的相对丰度增加，促进了根际微生物网络的健康程度，对小麦有很好的促生、防病和增产作用[54]。施用球毛壳菌ND35 菌剂能够改善根际土壤的化学性质及生物性质，从而促进楸树和平邑甜茶幼苗的生长[55,56]。同时球毛壳菌发酵液中存在能够促进植物生长发育的生长调节物质，对植物有明显的促生作用[49]。

2.3 诱导植物产生抗性

植物对病原物的抗性有两种不同的机制，即系统获得抗性（systemic acquired resistance，SAR）和诱导型系统抗性（induced systemic resistance，ISR）。诱导寄主抗性是研究生防制剂抑菌机理的一个重要且备受关注的领域。球毛壳菌具有诱发植物抗病性的功能，使植物对多种生物和非生物胁迫产生抗性。印容[25]证实球毛壳菌防治油菜根肿病的机制之一为可以诱导油菜的防御酶（PAL、POD 和PPO）活性升高，从而诱导系统抗性。球毛壳菌CEF-082 通过促进棉花抗性相关基因（β-1,3-glucanase、POD、PPO 和PAL）的上调表达，从而诱导棉花对黄萎病的抗性[14]。球毛壳菌NC-1 能够抑制小麦褐斑病菌Pyrenophora tritici-repentis在小麦叶片上的扩展，这种抑制作用可能是由于球毛壳菌诱导了细胞外蛋白质在寄主中的积累，从而促进寄主产生抗性[57]。Singh 等[58]通过时间转录组表明ISR 和SAR 信号途径均参与了球毛壳菌诱导的番茄系统抗性。球毛壳菌TAMU 520 能增强棉花对地下根结线虫和地上害虫的系统抗性[59]。此外，球毛壳菌ND35 能够促进小麦干旱诱导相关基因wzy2 的表达量，提高冬小麦耐脱水性和对干旱胁迫的适应性[60]；且该菌株显著提高楸树和黄瓜等的抗旱性[49,55]。在盐胁迫下，球毛壳菌D5 能够促进芍药的生长和光合作用，减轻盐胁迫引起的伤害，从而提高芍药的耐盐性[61]。

2.4 生态位和营养物质竞争作用

植物内生真菌进入寄主植物的方式与病原菌相似，可以优先占据病原菌的入侵位点，从而对病原菌产生生态位和营养物质竞争，抑制病原菌在植物体内的扩展，从而减轻病害的发生[23,24]。在离体条件下通常采用拮抗试验研究植物内生真菌与病原菌的生态位和营养物质竞争作用。岳会敏等[62]通过平板对峙试验表明球毛壳菌对立枯丝核菌R.solani、茄腐镰孢菌F.solani、大豆疫霉病菌P.sojae、核盘菌S.sclerotiorum和尖孢镰孢菌F.oxysporum的菌丝生长抑制作用主要是通过竞争作用和重寄生作用实现的。。

2.5 重寄生作用

真菌病原物能被其他真菌侵染或寄生，二者需要在空间上彼此邻近才能相互作用。叶丽丹等[63]通过构建和转化EGFP（Enhanced GFP）表达载体对球毛壳菌进行标记，用平板共培养、载玻片培养等方法发现，球毛壳菌对立枯丝核菌的拮抗机理主要是重寄生作用。Aggarwal 等[31]通过球毛壳菌6 个分离物与禾旋孢腔菌共培养试验发现，球毛壳菌Cg1 和Cg6 重寄生到禾旋孢腔菌菌丝中，因此没有产生抑菌带。刘晓光等[6]研究发现球毛壳菌ND35 可通过寄生作用寄生在齐整小核菌Sclerotiumrolfsii和立枯丝核菌内，寄生菌丝被缠绕、穿透和断裂。Gao 等[51]研究表明球毛壳菌寄生到立枯丝核菌内部后，使病原菌的细胞结构发生紊乱，细胞壁降解，且在重寄生互作过程中产生了几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶。

3 球毛壳菌在植物上的侵染定殖

球毛壳菌能否成功在植物中定殖及存活是其发挥生防作用的重要因素。研究表明球毛壳菌在杨树、黄瓜、辣椒、烟草和油菜等植物上均能良好定殖[23,25,47,64]。球毛壳菌在杨树和黄瓜上的侵染定殖研究表明[23,24,47]，子囊孢子萌发形成的菌丝从根、茎部表皮细胞的间隙侵入，或形成附着胞或菌丝足，进而形成侵染钉直接从表皮细胞侵入；在叶部主要从气孔侵入叶片内部。侵入根部的菌丝主要定殖于表皮细胞、外皮层细胞或细胞间隙，未发现进入内皮层和维管束组织。

4 球毛壳菌在植物上的应用潜能

4.1 球毛壳菌在防病促生方面的应用

基于球毛壳菌对多种植物病害有很好的防治效果，且能够促进植物生长，因此在植物防病促生方面有很大的应用潜能。泰国的Soytong 等[65]利用球毛壳菌和角毛壳菌的22 个株系配制成生物颗粒剂和生物粉剂，通过专利授权将产品注册并命名为“Ketomium®”。该产品已经成功应用于榴莲和黑胡椒疫霉菌P.palmivora、柑桔寄生疫霉P.parasitica、草莓恶疫霉P.cactorum和番茄萎焉病菌尖孢镰孢菌等的生物防治中起到较好的防控作用和治疗效果，同时能够促进植物的生长。

4.2 球毛壳菌对土壤改良作用

利用球毛壳菌制成菌肥，将在缓解连作障碍、改善土壤微生物群落结构和抑制病原菌种群数量方面有较好的应用潜能。土壤酶活性及微生物的数量和种群结构，是衡量土壤质量的指标之一。研究表明，施用球毛壳菌ND35 菌剂能够明显提高土壤中有机质、硝态氮和铵态氮含量及脲酶、蔗糖酶和碱性磷酸酶等土壤酶活性，提高土壤微生物多样性及丰度，从而促进楸树和平邑甜茶幼苗的生长[55,56]。米士伟[24]将培养后的球毛壳菌ND35 晾干后，用多功能粉碎机粉碎，制成微生物肥料，并且可以用蛭石作为菌肥填料。郭君兴[52]将球毛壳ND35 的固体发酵培养产物通过初步加工和添加剂的加入，开发研制出几种微生物肥料剂型。利用这些不同剂型的球毛壳ND35 生物肥料可以改善土壤环境及肥力，促进植物的生理活性，研究表明其对辣椒、黄瓜、小麦、核桃、杨树叶和甘薯等作物都有较好的肥效，且对干旱、盐分和高温胁迫都有较强的耐受能力[52,66]。

4.3 球毛壳菌降解秸秆的能力

微生物对纤维素的降解利用是自然界中碳素循环的主要环节，对解决世界能源危机和环境污染等方面具有重要的意义。球毛壳菌既能够分解利用纤维素，也能够分解木质素；能够产生活性较强的纤维素水解酶，以分解利用秸秆、咖啡豆和油棕榈树叶[67-70]。胡阳[3]分离到一株高效降解纤维素球毛壳菌NK102，通过转录组学探索了球毛壳菌培养过程中纤维素酶表达的规律，其中外切葡聚糖酶、纤维二糖脱氢酶和内切葡聚糖酶基因(cbh1，cdh和egl1)的表达量最高，且这些酶基因的表达受到营养、物理条件的影响，为揭示球毛壳菌降解纤维素分子机理提供了参考。由于秸秆上带有病原菌，而球毛壳菌的施用即能够降解秸秆，又能抑制植物病原微生物，因此球毛壳菌可能对秸秆还田造成的植物病害积累具有一定的控制作用，但相关报道较少，未来需在该方向进一步深入研究。

5 球毛壳菌发酵工艺研究

生防菌规模化生产的基础是发酵工艺的优化，而发酵工艺的基本目标是降低成本，简化工艺流程，获得最大产孢量或次生代谢物。目前较多研究通过正交试验，获得了影响产孢和活性物质生产的最佳组合。在产孢研究方面，郭君兴[52]通过优化培养方法和条件，筛选出一种性状优良、高产孢、适合工业化大规模生产的菌糠废料。用培养金针菇的菌糠废料培养球毛壳ND35，加水量为300 mL/kg 时获得最大产孢量为3.39×109孢子/g。在产活性物质研究方面，高建锋等[71]通过正交试验设计，以碳源、氮源、矿质元素、生长因子和pH 值为基本因子，获得了影响抗生物质产量的最佳组合，即1%葡萄糖，1%蔗糖，0.5%牛肉膏，0.02%硫酸亚铁，0.01%维生素B1，pH 值为7。葛飞等[18]通过正交试验对球毛壳菌SG0016 菌株的液体发酵条件进行了优化，以葡萄糖为碳源，酵母膏为氮源，接种量为10%，23 ℃温度下培养7 d，使发酵液的DPPH 自由基的清除率达到96.17%，与优化前相比提高了23.6%。阮璐璐等[72]对球毛壳菌素A 的发酵工艺进行了优化，最佳配方为蔗糖17 g/L，淀粉6 g/L，蛋白胨0.5 g/L，发酵13 d，使球毛壳菌素A 的发酵量达到0.17 g/L。姜成[73]研究表明色氨酸、正丙醇和正丁醇能够提高球毛壳菌素A 的生产效率及最终产量。为了降低发酵成本，建立并优化了以玉米秸秆为主要底物的发酵-纯化体系，最适条件为秸秆11.66 g，氯化铵0.67 g，培养温度为25.5 ℃，使球毛壳菌素A 产量达到3.7647 mg。这些研究成果为球毛壳菌产业化发展和应用奠定了良好的基础。

6 球毛壳菌的基因工程研究

通过微生物分子生物学方面的研究，寻找对活性物质的分泌有促进作用的基因改造方式，最终可达到提高活性物质生产效率的目的。刘志华[74]在球毛壳菌上克隆了重要生物防治相关基因内切几丁质酶基因（chi46）和C4-甲基甾醇氧化酶（sterol），并克隆了与球毛壳菌胁迫应答和生物降解相关的小热激蛋白基因、过氧化物膜蛋白基因和二烯醇内酯水解酶基因等，为揭示球毛壳菌生物防治分子机理和体内高价值酶基因的发掘提供依据。并将几丁质酶基因转化到酿酒酵母中，获得了能够大量生产几丁质酶的基因工程菌。目前研究较多的是球毛壳菌素生物合成相关基因的挖掘。姜成[73]对聚酮合酶C 骨架延长相关基因Cger进行过表达，使球毛壳菌素A 生产速率显著提高。同时研究发现CghdⅠ对球毛壳菌素A 的合成有抑制作用，通过插入性突变使其产量提高。Tao 等[75]通过对具有全局调控作用的laeA基因在球毛壳菌CBS148.51 中的过表达，促进了球毛壳菌素合成相关基因的表达量。近年来发现了一些新的可能参与球毛壳菌素A 合成或转运的基因，如光响应调控因子CgVeA、多效转录调控因子CgXpp1和外排基因CgMfs1等，将有利于促进球毛壳菌素在农业和生物医学领域的应用和商业化[76,77,78]。

7 球毛壳菌的生防效果影响因素

与化学药剂相比，生防菌制剂处理效果往往受环境因素的影响而呈现较大的变异性，很多生防菌在试验条件和田间自然条件下的生防效果有较大区别，在田间施用后由于定殖能力弱而降低防效[79-82]。球毛壳菌同样受温度、湿度、微生物、氧化作用和pH 等田间复杂环境的影响而呈现不稳定的生防效果[83]。Boudreau等[83]研究表明用球毛壳菌子囊孢子处理苹果叶片防治苹果黑星病，发挥重要作用的可能并不是菌体或孢子本身，而是菌体产生的活性物质，且处理后随着时间的延长，由于抗生物质受外界环境影响降解导致其生防效果逐渐下降。除了受环境因素的影响，毛壳菌本身对苯并咪唑类杀菌剂异常敏感，致使它无法与这类杀菌剂综合使用，对植物病害进行有效控制[84]。在不同浓度下球毛壳菌的应用效果不同，Xia 等[85]用7 个不同剂量（从0 到1.67 g/kg）的球毛壳菌ND35 菌肥处理连续轮作下的白杨，发现0.67 和1.00 g/kg的剂量下，植株高度最大，叶片、茎和根的生物量最大，能够有效促进白杨根系生理活性和光合利用率，但是浓度再升高反而效果下降。且球毛壳菌在植物体内发挥作用持续的时间有一定限制，李金花[55]研究表明球毛壳菌ND35 主要在胁迫前期通过提高酶系统的防御来提高楸树幼苗抗旱性，而在胁迫后期对酶系统的作用不再显著。此外，球毛壳菌不同施用方法和不同等渗水剂型对植物的防病促生效果也会有较大的差异[86-88]。这些研究为球毛壳生防菌剂的高效利用提供了理论依据。

8 球毛壳菌生物安全性评价

高建锋等[89]研究了球毛壳ND35 抗生物质粗提物对黄瓜、菜豆和小麦种子是安全的，对小白鼠、大白兔等动物来说属低级毒；子囊孢子在水中能自行消解，在浓度低于105cfu/mL 时对泥鳅生长无显著性影响。由此推断，球毛壳菌与其他微生物农药一样无毒、无污染，用于土传病害的生物防治无明显性风险。泰国的球毛壳菌和角毛壳菌产品“Ketomium®”在低于2×109cfu/kg 的剂量下对老鼠同样没有明显的毒性作用。关于球毛壳菌生物安全性和投放环境后的风险评估需进一步的深入探讨研究。

9 问题与展望

球毛壳菌具有很大的生防潜能，但其尚处于研究与开发的初始阶段，针对其应用受限因素，应进一步加强球毛壳菌对植物病原菌的生防机理研究，深入研究球毛壳菌与寄主植物、病原菌、其他微生物和环境之间的互作关系和变化规律，以便创造球毛壳菌的适宜生长环境，更好的发挥球毛壳菌的生防功能。其次，球毛壳菌次生代谢物中的多种活性物质，通过发酵、分离和提纯，进行大规模工业生产，有望成为新的、安全和高效的生物农药，但目前对球毛壳菌代谢产物的生物活性研究范围较为局限，某些活性物质的种类和性质尚不明确，因此对其化学成分的认识有待进一步完善，同时应加强对球毛壳菌分子生物学及其活性物质合成调控等相关方面的深入探索和研究，为寻找促进活性物质生产的基因改造方式和基因工程的应用提供理论依据。最后，在生产上需进一步研究并解决球毛壳菌固态发酵工艺流程、后处理技术、产品剂型、加工技术和质量标准等方面的问题，为球毛壳菌在农业生产上的应用推广奠定基础。