不同基因型大豆根际及根内促生菌的分离筛选

翟羽佳，蔡若楠，陈玺同，李欣恒，王欣，薛红，付学鹏

不同基因型大豆根际及根内促生菌的分离筛选

翟羽佳1，蔡若楠1，陈玺同1，李欣恒1，王欣1，薛红2，付学鹏1

（1. 齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2. 黑龙江省农业科学院 克山分院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

从10种不同基因型大豆（齐农26、齐农28、齐农33、齐农41、合丰50、合丰51、合丰55、黑河43、黑河45、农庆29）根际土壤及根内筛选具有促生能力的菌株共56株．其中，14株具有结瘤能力，2株具有固氮能力，44株具解磷能力，43株具溶磷能力，24株具IAA产生能力．由此可见，多株菌株同时具有多项促生能力．分别从中挑选3株综合促生能力较好的菌株QN15，N12，H16进行盆栽实验．结果表明，施加以上菌原液及稀释液均能显著提高植株株高、茎粗、根瘤数、结荚数、植株地上部分鲜质量及干质量．其中，与施加LB对照组相比，施加QN15原液、QN15稀释液、N12原液、N12稀释液、H16原液、H16稀释液分别提高植株地上生物量18%，29%，2%，26%，31%，2%．这些结果将为促生菌在农业上的应用提供参考．

大豆；促生菌；分离筛选

在农业生产中，化肥的过度使用导致土壤肥力、粮食产量和质量下降．为此，许多国家开始研发微生物肥料，其中植物根际促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR）的开发和利用成为了研究热点．PGPR是一类生活在土壤中或附着在植物根部的菌类微生物，可促进植物生长发育及其对矿质营养的吸收和利用，同时能抑制有害微生物生长[1]．它们与土壤微生物群表现出协同和拮抗的相互作用，并参与一系列生态活动[2]．这些根际微生物可能会大量产生促生长物质，从而间接影响植物的整体形态．因此，PGPR在农业中的潜力稳步增加，以一种新的方式逐渐取代化肥、杀虫剂等的使用．

PGPR促进植物生长发育的方式是帮助植物获取营养．在这方面，研究和应用最多的是根瘤菌和豆科植物之间的固氮共生．豆科植物能够与根瘤菌建立共生关系，形成根瘤，研究结果表明，根瘤可以有效固定空气中的氮气，并转化成植物可以利用的氨态氮，使用根瘤菌可以大量减少农作物生产过程中对工业氮肥的依赖[3]．这种能力是在大田作物栽培中使用细菌接种剂的基础[4]．根瘤菌的施用可以使作物增产，如施用含根瘤菌、固氮菌的复合菌剂可以使大豆增产36.1%[5]，同时大豆根际还存在大量具有溶磷、解磷、产IAA（吲哚乙酸）等功能的其他促生微生物，以及具有多项促生能力的菌株．

然而，微生物对植物的影响作用远不仅如此，促生微生物也与植物具有紧密的遗传学关联，不同基因型植株根系招募的有益微生物不同，植物功能类型的基因受到根际微生物群落组成的影响．因此，本研究从10种不同基因型大豆根际土壤及根内筛选具有促生能力的菌株，以期得到同时具有多项促生能力的菌株，为微生物菌剂的开发及利用奠定基础，从而更有效地提高大豆产量．

1　材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1大豆品种齐农26，齐农28，齐农33，齐农41，合丰50，合丰51，合丰55，黑河43，黑河45，农庆29（黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院）．

1.1.2土壤土壤为齐齐哈尔市富拉尔基区田土，其基本理化性质为：有机质质量浓度23.23 g/kg，碱解氮质量浓度293 mg/kg，有效磷质量浓度238.58 mg/kg，速效钾质量浓度93.21 mg/kg，pH7.23，电导率1.31 ms/cm．土壤过筛（4目），去掉大颗粒土壤和杂质，装盆前充分混合均匀备用．

1.1.3培养基LB培养基（1 L）：酵母5.0 g，NaCl 8.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂20.0 g，pH7.0，液体培养基不加琼脂．

7种分离培养基（1 L）：TSB培养基、TYG培养基、TWYE培养基、YEM培养基、M408培养基、M715培养基、Flour培养基，参考文献[6]的方法．

蒙金娜有机磷培养基（1 L）：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4·4H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，KCl 0.3 g，NaCl 0.3 g，CaCO35.0 g，卵磷脂0.2 g，琼脂20.0 g，pH7.0，液体培养基不加琼脂．

PKO培养基（1 L）：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，KCl 0.3 g，NaCl 0.3 g，Ca3（PO4）210.0 g，琼脂20.0 g，pH7.0，液体培养基不加琼脂．

1.2　实验方法

1.2.1大豆种植选择齐齐哈尔市广泛种植的10种不同基因型大豆，盆栽种植后，置放于齐齐哈尔大学温室（昼16 h 25℃/夜8 h 18℃），每个基因型种植5盆，每盆播种3粒，生长期间不施加化肥，每隔2 d浇水一次，每次200 mL．

1.2.2根际和根内微生物的分离取生长到R5阶段的不同基因型大豆植株根系，通过抖根法去除根系附着的大块土壤后，将附带根瘤的根系用无菌剪刀剪至无菌培养瓶中，放置超净工作台中，用无菌磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤后收集大豆根，包括根瘤[7]，用研钵和研杵将根样品在15 mL无菌PBS（pH=7.0）中研磨，6层无菌纱布过滤．滤液用无菌PBS稀释1 000倍．最后，将100 µL稀释的滤液分别在7种分离培养基上涂布，并在28℃下静置孵育1～2 d．待单菌落长出后，挑出单个菌落在各自的固体培养基上划线纯化，从这些固体培养基上再次挑取单菌落进行纯化，随后将所有单一菌株储存在40%的甘油中，在-80℃保存．

1.2.3菌株结瘤、固氮能力测定使用PCR（聚合酶链式反应）测定法鉴定菌株结瘤因子合成基因（NodA）和氮固定标志基因（NifH），PCR引物在上海生工合成，具体序列见表1．PCR反应体系为25 μL体系（酶12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，煮沸后的菌液1 μL，去离子水10.5 μL），置于PCR仪中，95℃预变性30 min，95℃变性30 s，40℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃终延伸7 min，其中变性、退火、延伸三步进行35个循环，最终将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测．

表1　NodA，NifH引物序列

1.2.4菌株溶磷、解磷能力测定将待测菌株接种到含15 mL无菌原分离液体培养基的无菌离心管中，28℃ 180 r/min震荡培养2 d，取2.5 μL菌液以四分法分别点接于蒙金娜有机磷固体培养基和PKO固体培养基上，28℃黑暗中恒温培养，10 d后观察各菌株的溶磷、解磷圈形成情况．

1.2.5菌株产IAA能力测定将待测菌株接种到15 mL含200 mg/mL色氨酸的无菌LB液体培养基的无菌离心管中，28℃ 180 r/min震荡培养2 d，得到菌株发酵液，8 000 r/min离心10 min，取上清液50 μL滴在白瓷板的凹槽内，再加入50 μL Salkowski比色液（0.5 mol/L FeCl3溶液15 mL，浓硫酸300 mL，蒸馏水500 mL），以等量0.05 mg/mL IAA标液做阳性对照，无菌LB液体培养基做阴性对照，避光显色30 min，观察颜色变化[10]．

1.2.6菌株安全性评价参考文献[11]的方法检测菌株的溶血性．将筛选到的综合促生能力较好的菌株接种到原分离液体培养基中，28℃ 180 r/min震荡培养2 d，取2.5 μL待测菌液，点接于血琼脂平板，每个菌株三次重复，置于保温箱35～37℃培养18～24 h，观察有无溶血圈产生．

1.2.7盆栽实验选择综合促生能力较强的菌株，在齐齐哈尔大学温室进行盆栽实验，验证其促生能力．盆栽使用塑料花盆的大小为13 cm×15 cm，每盆种植10粒大豆种子（黑河43），发芽7 d后，根据幼苗长势情况间苗至每盆3株，留下的苗长势一致．将待测菌株分别在其对应的液体培养基中28℃ 180 r/min震荡培养至OD600=1时，取10 mL菌液及10 mL稀释20倍后的菌液分别浇灌至大豆幼苗根部，每个处理设置4盆重复，分别取10 mL无菌液体培养基及10 mL无菌水浇灌作为对照组，其他条件一致．间苗后2 d开始浇灌菌液，每10天浇灌一次，共浇灌两次，浇灌菌液30 d后，采集植株进行形态学指标测定，包括株高、茎粗、根瘤数、结荚数、地上部干质量、地上部鲜质量、根部干质量、根部鲜质量．

1.2.8数据处理植株形态学指标使用Microsoft Excel 2019进行数据汇总；利用GraphPad Prism 8软件，采用检验对不同处理间的数据进行差异显著性分析（<0.05）及作图．

2　结果与分析

2.1　根系相关微生物的分离

本研究从10种不同基因型大豆根际土壤及根内共筛选到224株细菌，根据菌株的分离来源分别编号，以备下一步促生功能鉴定．

2.2　菌株促生能力测定

2.2.1结瘤及固氮能力测定将筛选得到的224株菌株利用2种引物NodA和NifH进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶电泳比对．最终得到14株具有结瘤因子合成基因的菌株，分别为H15，H16，H21，H4-3，HF25，HF28，HF50-11，HF55-23，N12，N13，QN15，Q26-08，QN41-2，QN41-21．其中，2株具有固氮基因的菌株，分别为H16，QN12．结果见图1和表2．

图1　结瘤及固氮能力测定

注：M为Marker；F为H16+NodA；G为H16+NifH；H为HF25+NodA；J为QN15+NodA；L为H21+NodA；N为N12+NodA；P为N13+NodA．

表2　各菌株促生能力

注：+为具有该功能，+越多，功能越强；－为不具有该功能．

2.2.2溶磷、解磷能力测定将筛选得到的224株菌株利用溶磷圈法在蒙金娜有机磷培养基检测，根据溶磷圈产生情况（见图2）得到具有溶磷能力的菌株43株（见表2）．

图2　各菌株溶磷圈结果

注：按照平板从左至右、从上至下，菌株从左上开始顺时针的顺序依次为H22，H23，H13，H24；H4-2，H4-3，H4-22，H4-1；H4-11，H4-12，HF55-01，HF55-22；HF50-12，HF50-17，HF50-18，HF50-19；HF20，HF22，HF25，HF27；HF55-21，HF55-23，Q26-06，Q26-08；Q26-10，Q26-22，Q26-11，Q26-09；Q26-07，QN12，QN41-22，QN41-23；QN28-01，QN28-02，QN28-06，H4-13；QN41-2，QN41-3，QN41-21，N14；N12，N15，QN13，QN15；H16，H21，H15，H14．

利用解磷圈法在PKO培养基检测，根据解磷圈产生情况（见图3）得到具有解磷能力的菌株44株（见表2）．

图3　各菌株解磷圈结果

注：按照平板从左至右、从上至下，菌株从左上开始顺时针的顺序依次为H13，H10，H11，H12；H14，H17，H18，H15；H24，HF28，HF26，HF20；H4-2，H4-3，H4-11，H4-12；HF50-11，HF50-12，HF22，HF25；QN41-22，QN41-23，HF27，N15；H16，H21，H22，H23；N13，N12，N14，HF55-01；HF50-18，HF50-17，HF50-19，HF50-16；QN28-01，QN28-02，QN28-06，QN41-1；Q26-09，Q26-10，Q26-07，Q26-06；QN13，QN15，QN11，QN12；QN14，H4-22，Q26-11，Q26-08；Q26-22，H4-13，HF55-22，H4-1；HF55-19，HF55-20，HF55-21，HF55-23；QN41-4，QN41-2，QN41-3，QN41-21．

2.2.3产IAA能力测定利用Salkowski比色法测定，根据显色结果（见图4）可见，有24株菌株出现粉红色，即得到具有产IAA能力的菌株24株（见表2）．

图4　各菌株Salkowski比色法显色结果

注：a从左至右依次为LB，H4-22，H4-13，H4-12，标液，H4-11，QN12，QN13，Q26-11，Q26-22，N13，N14；b从左到右依次为LB，HF25，HF26，HF27，标液，HF28，HF50-11，HF50-12，HF55-01，N12，H13，H14；c从左到右依次为LB，H15，H16，标液，H21，H22；d从左到右依次为LB，N15，QN11，标液，QN14，QN15．

2.2.4菌株安全性评价利用血平板法对筛选得到菌株进行溶血性检测，发现仅1株菌株出现溶血圈（见图5），已对其进行灭菌处理，销毁所有备份．

图5　各菌株溶血性检测结果

2.2.5盆栽实验根据促生能力测定，选择同时具有结瘤、固氮、溶磷、产IAA能力的菌株H16，及同时具有结瘤、溶磷、产IAA能力的菌株QN15和N12进行盆栽实验，进一步验证其促生能力（见图6）．结果表明，施加以上菌株发酵液原液及稀释液均能够显著提高植株的株高、茎粗、根瘤数、结荚数、植株地上部分鲜质量及干质量．同时，施加QN15原液、稀释液及H16原液显著提高了植株根部鲜质量，施加QN15原液、稀释液、N12稀释液及H16稀释液显著提高了植株根部干质量，即菌株QN15原液及稀释液的施加对植株以上8个指标均有显著提升．其中，与施加LB对照组相比，施加QN15原液、QN15稀释液、N12原液、N12稀释液、H16原液、H16稀释液分别提高了植株地上生物量18%，29%，2%，26%，31%，2%．结果见图7．

注：a从左到右依次为水对照，LB对照，QN15，稀释20倍QN15；b从左到右依次为水对照，LB对照，N12，稀释20倍N12；c从左到右依次为水对照，LB对照，H16，稀释20倍H16．

图7　施加不同菌液后植株形态学指标

注：-为稀释后的菌液；不同字母表示差异水平，≤0.05．

3　结论与讨论

研究表明，植物相关微生物群可以影响宿主植物的性状，包括抗病、营养状况、生长速率和耐受性[12-16]，因此分离和鉴定对寄主植物具有这种影响的有益微生物具有一定意义．本研究选取大豆作为研究对象，以生物固氮（BNF）为靶点，筛选可能对BNF相关基因有益的微生物，如氮固定标志基因（NifH）和结瘤因子合成基因（NodA），以测定菌株结瘤固氮能力[17-18]；而磷的有效性和氮的有效性一样，普遍受到限制，尤其是对豆科作物[19-20]．因此，鉴定能够改善大豆磷吸收的微生物也是本研究的重要目的．同时，还测试了IAA的产生能力，IAA能够调节植物的生长和发育[21]，而微生物IAA的产生与寄主植物的生长促进有关[22]．

本文从10种不同基因型大豆（齐农26、齐农28、齐农33、齐农41、合丰50、合丰51、合丰55、黑河43、黑河45、农庆29）根际土壤及根内共筛选到224株细菌，进一步筛选得到具有促生能力的菌株56株．其中14株具有结瘤能力，2株具有固氮能力，44株具解磷能力，43株具溶磷能力，24株具IAA产生能力．

虽然菌株促生能力得到证实，但并不代表在植物根系施用时能够对植物本身起到促生作用，虽然植物根系会释放信号因子，招募潜在的促生微生物，但在土壤和根际中，微生物群落的组成机制十分复杂，土著微生物的竞争能力较强，人为接种的促生菌存活率受到各种因素制约，能否成功定殖在植物根系具有不确定性．因此，选取综合促生能力较强菌株进行盆栽实验，最终成功筛选3株能够显著提高植株的株高、茎粗、结荚数、根瘤数、地上部鲜质量和干质量的促生细菌（<0.05），同时发现同一菌株不同浓度的施加对植株形态学指标的影响不显著．

在对大豆植株取样时发现，不同基因型大豆根系情况有很大差异，黑河43无论是植株生长情况或根系根瘤大小情况，整体较齐农28长势更好，因此后续菌株回接实验选择了黑河43品种．经过前人的研究以及本研究的结论，推测可能的原因为黑河43品种的大豆在生长过程中招募有益微生物能力较强，可以吸引支持植物生长的微生物在大豆根部聚集，为植物生长提供促进作用；而齐农28品种在此方面的能力较弱，在取样时期茎部及根系生长情况较差，成型根瘤较小，导致根系相关微生物丰富度显著低于黑河43，因此筛选促生菌株时，植株基因型的选择也极为重要．

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Isolation，screening of rhizosphere and root growth promoting bacteria from different genotypes of soybean

ZHAI Yujia1，CAI Ruonan1，CHEN Xitong1，LI Xinheng1，WANG Xin1，XUE Hong2，FU Xuepeng1

（1. School of Life Sciences，Agriculture and Forestry，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China；2. Keshan Branch，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Qiqihar 161006，China）

Screened 56 strains with growth promoting ability from the rhizosphere soil and roots of 10 different genotypes of soybeans（Qinong 26，Qinong 28，Qinong 33，Qinong 41，Hefeng 50，Hefeng 51，Hefeng 55，Heihe 43，Heihe 45，Nongqing 29）．Among them，14 strains had nodulation ability，2 strains had nitrogen fixation ability，44 strains had the ability to dissolve inorganic phosphorus，43 strains had the ability to dissolve organic phosphorus，and 24 strains had IAA production ability．It follows that，multiple strains have multiple growth promoting abilities at the same time．Three strains with better comprehensive growth promoting abilities，QN15，N12 and H16，were selected for pot experiment validation．The results showed that the application of the above bacterial stock solution and diluent significantly increased the plant height，stem diameter，nodule number，pod number，fresh and dry mass of the aboveground parts of the plant．Compared with the LB control group，applying QN15 stock solution，QN15 diluent，N12 stock solution，N12 diluent，H16 stock solution，H16 diluent respectively increased the aboveground biomass of plants by 18%，29%，2%，26%，31%，2%．These results will provide reference for the application of probiotics in agriculture．

soybeans；growth promoting bacteria；separation screening

1007-9831（2023）12-0074-09

Q93

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2023.12.013

2023-07-12

黑龙江省属本科高校基本科研业务费科研创新平台项目（135509317）；2023年大学生创新创业项目（x202310232041）

翟羽佳（1999-），女，黑龙江五大连池人，在读硕士研究生，从事微生物资源开发与利用研究．E-mail：1051233959@qq.com

付学鹏（1979-），男，山东临沂人，副教授，博士，从事微生物资源开发与利用研究．E-mail：02383@qqhru.edu.cn