木通果皮多糖提取工艺的优化

潘婷

摘要：本次实验对木通果皮粗多糖提取工艺进行了研究。采用热水回流提取，经苯酚硫酸法进行含量测定，先单因素依次考察对木通果皮多糖得率的影响，再采用正交优化提取次数、料液比、醇沉浓度在3个不同水平下提取工艺条件。结果表明，在提取温度为96℃（本地沸腾时的温度）、提取次数为3次（每次1 h）、料液比（样品：提取液g/ mL）1：25，多糖得率为65.4%，RSD=3.72%；木通果皮多糖的提取率高且穩定。

关键词：木通果皮；多糖；正交试验；提取工艺

木通原名通草，别名八月扎茎、菠知子藤等，是木通科木通属植物木通 、三叶木通 、白木通干燥果实和藤茎。具有利尿通淋、清心除烦、抗菌消炎的功效。木通果皮含有丰富的多糖和黄酮，但目前对木通果皮多糖含量的提取工艺的研究很少。本次研究木通多糖提取工艺及含量的测定，主要采用正交实验法对木通多糖最佳提取工艺的确立，再有对其含量的测定，为以后有研究木通多糖方面的工作者提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1 主要实验仪器

JH型721紫外分光光度计、FA2004电子天平、电子天平、离心机、循环水式多用真空泵、电热恒温水浴锅、高功率数控超声波清洗器、高速万能粉碎机、TDL-50B-B型星科离心机、DZF-6050型真空干燥箱。

1.1.2 研究药材与试剂

木通果皮药材来源于贵州省绥阳县永乐镇，无水乙醇、氯仿、正丁醇、5%苯酚溶液、浓硫酸。

1.2 研究方法

1.2.1 标准曲线的制备

先配置0.1 mg/ mL的葡萄糖对照品溶液，再按如下表吸取相应的对照品溶液于具塞刻度试管中，而后依次加入1 mL的5%苯酚溶液、5 mL浓硫酸，每加一次试剂均需摇匀；末了再静置放置l0 min，再放入90℃的水浴锅中反应，1号为空白对照，用紫外分光光度计490nm波长处测吸光度值（A）的回归方程如下。详见表1、图1

1.2.2 木通果皮的预处理

取一定量于55℃干燥至恒重的木通果皮干制品，粉碎、过筛40目后，装袋做待测样品，以备下面提取测定木通果皮多糖含量。

1.2.3 木通果皮的提取

本试验对样品采取水提法，具体如下：精密称取上述粉碎过筛后的木通果皮样品3.000 g置于圆底烧瓶中，加15倍量体积的蒸馏水，置于水浴锅中一定温度下，回流提取3次，每次1h，合并提取液，静置冷却至室温，用低速离心机2000 r/min离心15 min左右，至提取液清晰分层，倾出上层清澈溶液于同一容器中，再用真空泵进行抽滤除取离心后溶液里含的少量药渣，滤液于旋转蒸发仪中浓缩之后取出。

1.2.4 木通果皮粗多糖的获得

再将浓缩液用Sevag试剂法脱蛋白，目前报道的木通多糖提取液里蛋白质的去除用的也是这种方法（但氯仿对人体也有一定毒性，操作时应注意）。收集上清液，浓缩以除去氯仿等有机试剂。向浓缩液加入乙醇，析出絮状沉淀，静止使沉淀完全。再对沉淀进行离心并回收乙醇，55℃真空干燥，即得木通粗多糖。

1.2.5 紫外光分光光度计法对木通果皮多糖含量的测定

将上述所得多糖先用少量温水溶解完全再定容到一定体积的容量瓶中，精密吸取样品液，先加入5%苯酚溶液，再加入1.0 mL的5%苯酚溶液及5.0 mL浓硫酸，摇匀后静置几分钟，并放入90℃的水浴锅中反应，冷却至室温，放置在紫外分光光度计中，再将用490 nm波长测定的吸光度值（A）代入标准曲线方程，计算出样品浓度。

1.2.6 木通果皮多糖含量的计算

木通果皮多糖的得率（%）=（C×F×10-3/W）×100%

式中：C：样品溶液浓度（mg/ mL）；

F：稀释系数，即稀释后的总体积。

W：称取的木通果皮多糖的质量（g）。

则此次所测3.00 g的多糖含量为50.13%

1.2.7 木通果皮多糖最佳提取条件的确定

先考察提取次数、醇沉浓度、料液比、提取温度对木通果皮在单因素条件下的木通多糖的所得率，为了考察各因素之间的相互影响，在此基础上设计3因素3水平的正交实验来明确木通多糖水提法的最佳提取条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取温度对木通果皮多糖提取工艺的影响

精密称取3 g左右的木通果皮粉末，每组3份，置于圆底烧瓶中，料液比为1：20，按醇沉浓度70%加入乙醇，提取温度分为60℃、80℃、96℃（沸腾），提取次数为2次，每次提取1h，其余操作依照“1.2.3～1.2.6”项所示得到待测液并计算其多糖的含量，考察提取温度对木通果皮多糖的提取率的影响，

实验结果为提取温度为60℃、80℃、96℃（沸腾）的多糖所得率分别为21.19%、32.61%、50.63%。可以看出当温度为96℃时，即本地的沸腾温度时达到最大值50.63%，这是由于多糖的溶解度随着温度的升高而增大了，以及高温下有对木通果皮细胞壁的破坏作用，使得糖利于溶出，所以提取温度选取96℃（即沸腾时温度）为最佳提取温度。

2.1.2 提取次数对木通果皮多糖提取工艺的影响

精密称取3 g左右的木通果皮粉末，每组3份，置于圆底烧瓶中，提取次数设置为1、2、3、4，料液比

1：20，每次提取1h，置沸水浴中回流提取，醇沉浓度为70%，其余操作依照“1.2.3～1.2.6”项所示得到待测液并计算其多糖的含量。

实验结果为提取次数分别为：1、2、3、4次的多糖所得率分别为21.7%、23.79%、48.97%、49.16%，随着提取次数的增加，木通果皮多糖的得率呈现上升趋势，从2次到3次上升最大，1次到2次次之，到3～4次时基本趋于平缓，增加幅度最小；因此综合考虑到之后步骤的简化以及经济因素，提取3次或4次可能较好。

2.1.3 提取溶剂用量对木通果皮多糖提取工艺的影响

精密称取3 g左右的样品，每组3份，置于圆底烧瓶中，分别按料液比：1：10、1：15、1：20、1：25加入相应蒸馏水，提取次数为2次，每次1h，置沸水浴中回流提取，醇沉浓度为70%，其余操作依照“1.2.3～1.2.6”项所示得到待测液并计算其多糖的含量，考察料液比对木通果皮多糖取得率的影响。

实验结果为：料液比1：10、1：15、1：20、1：25的木通多糖的平均值分别为35.95%、35.97%、42.85%、43%。由此可以看出木通果皮多糖的提取率随着料液比的增大而提高，从1：10到1：15多糖得率增加缓慢，只有0.2%；但从1：15～1：20时增大了6.88%，幅度较大；而之后又趋于平缓，1：20～1：25增大了0.15%，而提取成本增加；因此，可能料液比在1：20 左右在多糖得率较好的前提下，成本也较低。

2.1.4 醇沉浓度对木通果皮多糖提取工艺的影响

精密称取3 g左右的木通果皮粉末，每组3份，置于圆底烧瓶中，料液比为1：20，提取次数为2次，每次1h，置沸水浴中回流提取，醇沉浓度设置为80%、70%、60%、50%，其余操作依照“2.2.3～2.2.6”项所示得到待测液并计算其多糖的含量，考察醇沉浓度对木通果皮多糖取得率的影响。

结果：醇沉浓度分别为80%、70%、60%、50%，多糖所得率分别为40.93%、39.21%、32.52%、20.12%。由此可以看出，醇沉浓度对木通果皮多糖的提取率有较大影响，浓度越大多糖所得率越高，其间醇沉浓度50%～70%的上升使得多糖多得率的提高较大，从70%～80%时随着醇沉浓度的增大，多糖所得率的提高较缓慢。这有可能是醇沉浓度低时，一些低小分子低聚糖的沉淀不完全，结果偏低；而当醇沉浓度高时含有的极性较大的苷类等成分也沉淀下来，致使结果偏高，因此也许70%左右的为较好的醇沉浓度。

2.2 木通果皮多糖的最佳提取工艺的正交实验分析

依据单因素试验的实驗结果，设置提取条件为：温度为沸水浴96℃、提取次数（A）、料液比（B）、醇沉浓度（C）来设计正交优化试验（表2）。并在上述这3个单因素实验对木通果皮提取率的影响结果基础上设定每个因素3个水平，在平行操作下，按

L9（34）正交实验设计表，以得多糖得率作为评价指标对木通果皮多糖提取工艺条件优化。

2.2.1 正交优化实验结果与讨论

实验得出以多糖得率为指标，提取次数，料液比、醇沉浓度的F值均小于F0.05（2，2），则这三者对木通果皮多糖得率都没有显著影响。而由正交实验结果分析中RA、RB、RC分别为0.158、0.159、0.192，则RC>RB>RA，A、B、C三因素对木通果皮多糖得率影响的主次顺序是醇沉浓度>料液比>提取次数。上述结果分析表明，木通果皮多糖的最佳提取工艺为提取次数为3次，料液比为1：25，醇沉浓度为85%，而最佳提取温度为96℃。详见表3。

2.2.2 最佳工艺的验证

精密称取木通果皮药粉样品3份，每份均为3 g，按上述最佳提出条件进行木通多皮多糖的测定，得到平均得率为65.4%，RSD=3.72%，表明工艺重复性较好，提取多糖含量稳定。

3 结论

本试验是以干燥后的木通果皮为材料，利用热水提取，醇沉法得到粗多糖，确定了最佳条件为：提取温度为96℃（本地水沸腾时的温度）、提取次数是3次，每次1h、醇沉浓度85%、料液比为1：25，多糖得率为65.4%。验证实验表明，该工艺温度，重复性较好。

水提法的植物多糖多含有些许蛋白、色素等杂质，这些物质对于植物多糖的测定可能会有影响。本实验在进行去蛋白时，所产生的白色絮状物不多几乎没有，据此可初步得出木通果皮的蛋白质含量应该不高，对多糖的含量测定影响不大。根据本次实验测得数据可以看出，热水提取木通果皮多糖的提取率还是较高的，但多糖的提取法有多种，如可以超声波提取、酸碱辅助提取、酶解提取等，或参考已研究出的某种植物多糖的提取方法，结合几种提取方法混合提取。因此，最适合木通果皮多糖的提取方法，待今后研究者的进一步研究。

参考文献

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