鲜食葡萄采后霉菌的分离与鉴定

2024-01-15付清泉王方方李甜史学伟王斌

食品安全导刊·中旬刊 2023年11期

付清泉王方方李甜史学伟王斌

基金项目：国家自然科学基金（31960465）；石河子大学青年创新人才培育计划（CXBJ202004）；五师科技计划项目（202101）；七师科技计划项目（2022B01）。

作者简介：付清泉（1997—），男，河南信阳人，硕士。研究方向：食品微生物。

通信作者：王斌（1985—），男，湖南株洲人，博士，副教授。研究方向：食品微生物。E-mail：binwang0228@shzu.edu.cn。

摘要：本研究以“红提”葡萄为原料，采用经典微生物纯培养技术从葡萄表皮分离致腐霉菌，根据柯赫法则对致腐性霉菌进行验证，采用形态学分析和ITS测序对致腐霉菌进行鉴定。结果表明，“红提”葡萄表皮致腐霉菌主要有链格孢菌、黑曲霉、黄曲霉。本研究可为鲜食葡萄贮藏保鲜过程中霉菌的防控提供理论依据。

关键词：葡萄；霉菌；分离与鉴定；返接

Isolation and Identification of Epidermal Mold from Fresh Grape

FU Qingquan， WANG Fangfang， LI Tian， SHI Xuewei， WANG Bin*

（School of Food Science and Technology， Shihezi University， Shihezi 832000， China）

Abstract： In this study， using “Hongti” grape as raw material， rot-causing fungi were isolated from grape epidermis by classical microbial pure culture technology. The rot-causing fungi were verified according to Kochs law， and identified by morphological analysis and ITS sequencing. The results showed that the pathogenic fungi of “Hongti” grape skin mainly included Alternaria alternata， Aspergillus niger， and Aspergillus flavus. This study provide a theoretical basis for the prevention and control of mold in the process of fresh grape storage and preservation.

Keywords： grape; mould; isolation and identification; return connection

葡萄屬于葡萄科葡萄属浆果类水果，分布广泛[1]。葡萄不仅味美多汁，而且营养十分丰富，富含维生素、花青素、多酚类物质，具有抗氧化、抗衰老、预防癌症和缓解低血糖等多重功效，深受广大消费者喜爱[2]。由于葡萄汁多皮薄，采后极易受到各种病原微生物的侵染，使果实表面失水皱缩和破裂，造成全果腐烂变质，缩短葡萄贮藏期，降低葡萄果实品

质[3-4]。引起葡萄果实腐败变质的真菌主要有霜霉菌、灰葡萄孢、黑曲霉等，分别可引起葡萄霜霉病、灰霉病、黑粉病等，严重影响葡萄的外观品质和销售价值[5-6]。因此，了解葡萄表皮优势腐败霉菌的组成，对延长葡萄的贮存期具有十分重要的指导意义。

以石河子市“红提”葡萄为实验材料，采用传统的微生物分离手段对鲜食葡萄采后常温贮藏过程中腐败变质的葡萄果实表面致腐霉菌进行分离与筛选，明确引起葡萄采后腐烂变质的主要致腐霉菌种类。经形态学、显微观察、真菌ITS区测序分析，对致腐霉菌进行分类鉴定，确定采后常温贮藏过程中的优势腐败霉菌种类。该研究采用致腐性实验和返接侵染实验验证相结合的方式，最终确定采后葡萄的优势腐败霉菌，为鲜食葡萄果实贮藏保鲜过程中霉菌的防治提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄品种为“红提”，在石河子市本地采摘后置于（25±0.5）℃贮藏；PDA培养基；北京索莱宝真菌基因组DNA提取试剂盒。

1.2 仪器与设备

SFC-288光学显微镜，上海光学仪器有限公司；BSA224S万分之一电子天平，济南欧莱博科学仪器有限公司；LabCycler梯度PCR仪，德国SensoQuest有限责任公司；YXQ-100G立式压力蒸汽灭菌器，上海东亚压力容器制造有限公司；MJ-70F-I微生物恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；GelDoc XR+凝胶成像仪，伯乐生命医学产品有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄表面霉菌的分离纯化与保藏

称取葡萄10 g，放入90 mL无菌的生理盐水中，在摇床中摇晃4 h后制成质量浓度为10-1 g·mL-1的菌液。然后以10倍梯度稀释成10-2 g·mL-1、10-3 g·mL-1、

10-4 g·mL-1等不同质量浓度的菌液。分别吸取不同浓度的菌悬液100 μL均匀涂布于马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培养基中，28 ℃倒置培养3～5 d。选择菌落形态特征完全不同的霉菌，采用三点法转接到新的PDA培养基上，28 ℃，3～

5 d，连续培养2～3次，直至培养基上出现单一菌落。将纯化后的单一菌落转接至PDA斜面培养基中28 ℃培养5～7 d，4 ℃保存备用[7-8]。

1.3.2 葡萄表面霉菌的形态观察

采用插片法，在接种纯化后的霉菌菌丝PDA培养基中倾斜插入灭菌干燥的盖玻片，经培养3～5 d后轻轻取出盖玻片置于40倍显微镜下观察霉菌的菌落形态、颜色、生长情况和形状等，参照真菌形态学鉴定手册对不同霉菌种类进行初步鉴定，确定葡萄表皮霉菌的组成[9]。

1.3.3 葡萄表面霉菌的菌株鉴定

参照索莱宝真菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取DNA溶液于-20 ℃保存备用。以提取出的霉菌DNA为模板，进行PCR扩增。反应结束后，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测[10]。检测无误后将产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将得到的序列在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中使用GenBank中的Blast软件进行序列比对，然后用MEGA-X软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育树，对序列的相似性进行分析[11]。

1.3.4 返接实验

选取形状相似新鲜无病害的葡萄，用75%乙醇浸泡5 s，无菌水清洗3次后取出、晾干水分备用。用灭菌牙签在果实腰部穿刺3次，挑取纯化后的霉菌菌丝接入孔内，置于灭菌培养皿中，盖上灭菌纱布，每天观察葡萄发病情况。根据科赫法则，观察返接葡萄果实上的致腐霉菌与此前分离纯化菌种是否

相同[11-12]。

1.3.5 温度对葡萄表皮霉菌生长情况的影响

将培养3～5 d的霉菌采用点接法接种至新的PDA平板上，分别在20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃和30 ℃的培养箱中培养7 d。每隔24 h测定菌落直径，每个平行重复3次，考察霉菌在不同温度下的生长情况。

1.4 数据统计与分析

运用NCBI中的Blast对ITS区扩增产物序列进行在线比对，并下载相似序列，采用MEGA-X构建致腐霉菌的系统发育树。

2 结果与分析

2.1 葡萄表面霉菌菌落形态描述

对新疆维吾尔自治区石河子市的鲜食“红提”葡萄进行采后常温贮藏霉变后，通过对腐败葡萄表皮的霉菌进行3～5次分离纯化，得到了菌落颜色、形状等不同的8种霉菌，分别命名为M1、M5、M6、M7、M8、M9、M12和M18，如图1所示。

2.2 葡萄表面霉菌的ITS区序列分析

利用NCBI在线比对8种病原霉菌的PCR扩增序列。对部分同源性较高的菌株，运用MEGA-X构建系统发育树，确定该菌株的系统发育位置，如图2所示。8种霉菌序列比对发现，霉菌M1同源性较高的菌株ITS序列是毛霉属菌种，霉菌M7、M8、M12同源性较高的序列是曲霉属，霉菌M5同源性较高序列是链格孢属菌种，霉菌M6同源性较高序列是篮状菌属菌种，霉菌M9同源性较高序列是茎点霉属菌种，霉菌M18同源性较高序列是青霉属。真菌形态学对比和序列比对分析表明，霉菌M1、M5、M6、M7、M8、M9、M12和M18分别为卷枝毛霉、链格孢菌、沃特曼篮状菌、赭曲霉、黑曲霉、桑茎点霉、黄曲霉和青霉。

2.3 返接实验

为考察采后引起葡萄腐败的优势腐败菌，将从常温贮藏腐烂的葡萄中分离出的8种霉菌人工返接于灭菌的葡萄中，以灭菌穿刺不接菌的葡萄为对照，观察其霉变状态和速度。由图3可知，葡萄M的果粒饱满，颜色鲜艳有光泽，品质较好。M5、M8、M12对采后葡萄的品质影响较大，表现为严重失水皱缩，无光泽，并且表皮基本被霉菌覆盖，霉变较严重。从返接发病后的葡萄上进行霉菌的分离纯化，得到同种病原霉菌。由科赫法则[12]可知，链格孢菌、黑曲霉、黄曲霉3类霉菌为导致葡萄货架期病害的主要病原菌，其中黑曲霉是导致葡萄严重霉变的

菌株。

M—新鲜的鲜食葡萄；M0—穿刺后不接菌的葡萄；其余为穿刺后接入相应霉菌的葡萄。

2.4 温度对霉菌生长情况的影响

温度是影响霉菌生长速度的重要因素之一。观察黑曲霉在20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃及

30 ℃下的生长情况，结果见图4。黑曲霉最适生长温度为28 ℃，20 ℃时其菌落直径最小。高温虽然可以抑制霉菌的生长，但也会加速果实中水分的蒸发，不利于果实的贮藏。低温不仅可以抑制霉菌的生长，还有利于抑制果实中各种酶的作用，减少果实自身损耗[13]。因此，低温贮藏可适当延长果品的贮藏期，提高经济效益。

3 结论

对石河子市采后葡萄表皮霉菌进行分离纯化，联合真菌形态鉴别以及PCR扩增测序进行分子生物学鉴定，分离出8种不同的霉菌，分别为卷枝毛霉、链格孢菌、沃特曼蓝状菌、赭曲霉、黑曲霉、桑茎点霉、黄曲霉和青霉。将纯化的8种霉菌返接于葡萄果实，确定引起鲜食葡萄贮藏期腐败变质的优势致病霉菌为链格孢菌、黑曲霉、黄曲霉。本研究采用自然侵染实验和人工返接侵染实验验证相结合的方式最终确定优势腐败菌，可为后续鲜食葡萄贮藏中腐败微生物的防治提供理论基础，减少果品染病的发生率，进而提高经济效益。

参考文献

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